黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)屬(1qav/virus)包含(han)80多(duo)個成員，屬于(yu)正鏈(lian)RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，其(qi)(qi)中半數以上(shang)的病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)能(neng)夠誘發人(ren)(ren)和動物產生疾病(bing)(bing)(bing)，患病(bing)(bing)(bing)率高而治愈率低，容易留下一(yi)些(xie)嚴重的后遺癥，給人(ren)(ren)類健康帶(dai)來很大威脅，如流行性乙(yi)型腦炎(yan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(JEV)、登革熱病(bing)(bing)(bing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(DEN)、黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(YFV)、蜱傳(chuan)腦炎(yan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(TBEV)等(deng)。一(yi)直(zhi)以來人(ren)(ren)們對RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的了(le)解都比較缺(que)乏(fa)，無論(lun)是分(fen)子水(shui)平上(shang)的機理研究(jiu)，還是宏(hong)觀上(shang)疫苗的研制、藥物的開發，其(qi)(qi)進展都非常(chang)緩慢。
嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)是一種(zhong)基因工程重(zhong)組(zu)病(bing)毒(du)(du)，在(zai)(zai)制備技術上并不存(cun)在(zai)(zai)太大問(wen)題，但作為(wei)(wei)重(zhong)組(zu)病(bing)毒(du)(du)，在(zai)(zai)安全性(xing)上還有(you)(you)一定的(de)(de)風險，在(zai)(zai)自(zi)然條(tiao)件下(xia)，有(you)(you)病(bing)毒(du)(du)之間(jian)自(zi)發產生重(zhong)組(zu)的(de)(de)例(li)子，可能(neng)獲得一些意(yi)想不到的(de)(de)新型病(bing)毒(du)(du)，比母體(ti)株毒(du)(du)力更強，對生物體(ti)更具有(you)(you)威脅(xie)性(xing)。所以(yi)在(zai)(zai)制備嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)時(shi)，要采用(yong)(yong)已知特性(xing)的(de)(de)病(bing)毒(du)(du)株作為(wei)(wei)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)骨架結構(gou)，特別是多選(xuan)用(yong)(yong)減毒(du)(du)株作為(wei)(wei)載體(ti)病(bing)毒(du)(du)目前黃熱病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)采用(yong)(yong)的(de)(de)載體(ti)主要有(you)(you)以(yi)下(xia)幾種(zhong)。
YF一(yi)(yi)(yi)17DD 疫(yi)(yi)苗株(zhu)(zhu)(zhu) YF一(yi)(yi)(yi)17DD是(shi)目前(qian)預防黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)感染的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)株(zhu)(zhu)(zhu)減毒(du)(du)(du)活疫(yi)(yi)苗】，始(shi)用于1936年，在(zai)過(guo)去的(de)(de)(de)(de)(de)6O多(duo)(duo)(duo)年中(zhong)，有(you)超(chao)過(guo)3億人接(jie)種(zhong)(zhong)過(guo)該疫(yi)(yi)苗，安全有(you)效(xiao)。該疫(yi)(yi)苗株(zhu)(zhu)(zhu)免(mian)疫(yi)(yi)原性(xing)(xing)很好，單劑量接(jie)種(zhong)(zhong)后10d內，近lo0%的(de)(de)(de)(de)(de)接(jie)種(zhong)(zhong)者(zhe)(zhe)產生(sheng)中(zhong)和(he)(he)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)，免(mian)疫(yi)(yi)力持(chi)久甚至能夠維持(chi)終身。將YF一(yi)(yi)(yi)17DD疫(yi)(yi)苗株(zhu)(zhu)(zhu)和(he)(he)原病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)YF—Asibi進行(xing)序列比較(jiao)后發(fa)現，該病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)原表位多(duo)(duo)(duo)集(ji)中(zhong)在(zai)E基因，構(gou)建嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)多(duo)(duo)(duo)以(yi)(yi)這一(yi)(yi)(yi)段基因作為靶基因。這樣構(gou)建的(de)(de)(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)中(zhong)，由YF一(yi)(yi)(yi)17DD株(zhu)(zhu)(zhu)保留的(de)(de)(de)(de)(de)NS蛋白(bai)基因只是(shi)誘發(fa)針對該蛋白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)CTLs和(he)(he)非中(zhong)和(he)(he)性(xing)(xing)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)，而不具(ju)有(you)交(jiao)叉保護性(xing)(xing)，所以(yi)(yi)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)作為疫(yi)(yi)苗使用時(shi)不會(hui)引起一(yi)(yi)(yi)般重組病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)帶來的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)免(mian)疫(yi)(yi)反應，即使曾經接(jie)種(zhong)(zhong)過(guo)YF一(yi)(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)(de)(de)接(jie)痘者(zhe)(zhe)再接(jie)種(zhong)(zhong)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)也(ye)是(shi)安全有(you)效(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)，可以(yi)(yi)作為一(yi)(yi)(yi)個(ge)理想的(de)(de)(de)(de)(de)活疫(yi)(yi)苗株(zhu)(zhu)(zhu)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)。1989年Rice等(deng)151構(gou)建了YF一(yi)(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)(de)(de)感染性(xing)(xing)克隆，為構(gou)建嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)提供了方便，目前(qian)文(wen)獻(xian)中(zhong)報道的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)關黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)株(zhu)(zhu)(zhu)多(duo)(duo)(duo)以(yi)(yi)此病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)作為載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。已(yi)經成(cheng)功構(gou)建了包括JEV、TBE、WNV、DEN等(deng)4個(ge)血清型病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)體(ti)(ti)(ti)。
YF一17DD 疫苗株
DEN一(yi)4變異株(zhu) 登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)分(fen)為(wei)4個(ge)血清(qing)型，這(zhe)4型病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)結(jie)構蛋(dan)白氨基酸序(xu)列同源(yuan)性(xing)(xing)高(gao)達62%-74%，并(bing)且它們之間還有很(hen)好(hao)的(de)交叉免疫(yi)原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)，一(yi)直以(yi)來，人們試圖構建(jian)(jian)登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)4價疫(yi)苗，Bray等從(cong)1991年開始登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)研究(jiu)，以(yi)DEN一(yi)4814669株(zhu)全(quan)長(chang)克(ke)隆作為(wei)載(zai)體(ti)(ti)，構建(jian)(jian)了包括(kuo)DEN—l到(dao)DEN一(yi)3的(de)嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)，結(jie)果發(fa)現幾株(zhu)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)并(bing)沒(mei)有太大改變，他們認為(wei)若能夠以(yi)一(yi)個(ge)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)低的(de)DEN-4病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)作為(wei)載(zai)體(ti)(ti)骨架，可能會使嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)下降，由于(yu)3端(duan)(duan)和(he)5端(duan)(duan)非編(bian)碼區(qu)在(zai)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)復制中可能也(ye)起(qi)到(dao)調控(kong)作用，他們在(zai)構建(jian)(jian)的(de)DEN一(yi)4感染(ran)性(xing)(xing)克(ke)隆的(de)基礎上，刪(shan)除其(qi)3端(duan)(duan)和(he)5端(duan)(duan)非編(bian)碼區(qu)的(de)部(bu)分(fen)序(xu)列，結(jie)果篩選(xuan)到(dao)一(yi)株(zhu)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)，其(qi)3端(duan)(duan)去掉了3O個(ge)核(he)苷酸，毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)降低但是(shi)免疫(yi)原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)并(bing)沒(mei)有改變。用這(zhe)個(ge)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)作為(wei)載(zai)體(ti)(ti)和(he)其(qi)它3個(ge)血清(qing)型的(de)登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)構成嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)后，果然(ran)有效(xiao)地降低了病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)；其(qi)后這(zhe)個(ge)載(zai)體(ti)(ti)也(ye)用于(yu)構建(jian)(jian)黃熱病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)屬其(qi)他成員的(de)嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)。
DEN一4變異株(zhu)
DEN一2 PDK一53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu) 該(gai)(gai)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)也主(zhu)要(yao)是(shi)用于(yu)合成(cheng)登革(ge)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)嵌(qian)合疫苗(miao)，2O世紀(ji)8O年代初期，泰國Mahidol實驗室將4種血清型的(de)登革(ge)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)經過在細胞傳代中后獲(huo)得各自的(de)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)，其(qi)中以DEN一2PDK一53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)效(xiao)果最(zui)好，免疫保(bao)護力最(zui)強最(zui)持(chi)久。將該(gai)(gai)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)和(he)(he)野生株(zhu)進行比較，發現核苷酸水(shui)平上的(de)變異主(zhu)要(yao)在非(fei)結構(gou)(gou)區(qu)，說(shuo)明該(gai)(gai)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)和(he)(he)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)力有關的(de)基(ji)因可(ke)能在非(fei)結構(gou)(gou)區(qu)，而黃(huang)熱病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)屬(shu)其(qi)他成(cheng)員的(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)力基(ji)因多位于(yu)E蛋白，這樣構(gou)(gou)建的(de)嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)機制主(zhu)要(yao)由供體(ti)(ti)株(zhu)的(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性起主(zhu)要(yao)因素，而由DEN一2PDK-53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)構(gou)(gou)建的(de)嵌(qian)合疫苗(miao)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性的(de)減(jian)弱由供體(ti)(ti)和(he)(he)受體(ti)(ti)共同決定，更有利(li)于(yu)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)的(de)獲(huo)得
DEN一2 PDK一53減毒株
DEN一(yi)(yi)(yi)2減(jian)(jian)毒(du)株作(zuo)(zuo)為嵌合病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)載體(ti)還(huan)有另(ling)外一(yi)(yi)(yi)個好(hao)處(chu)，登(deng)(deng)革(ge)(ge)病(bing)毒(du)4個血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)之(zhi)間產(chan)生交叉(cha)(cha)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力(li)，所(suo)以(yi)異型(xing)(xing)病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)二次感(gan)染(ran)由于抗體(ti)依賴的(de)(de)(de)(de)增強作(zuo)(zuo)用可(ke)以(yi)導致(zhi)登(deng)(deng)革(ge)(ge)出血(xue)(xue)(xue)熱(re)/登(deng)(deng)革(ge)(ge)熱(re)休克綜合征(DHF/DSS)的(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)生，理想(xiang)的(de)(de)(de)(de)登(deng)(deng)革(ge)(ge)4價疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗誘(you)導的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力(li)要針(zhen)對4種血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)病(bing)毒(du)，有效而(er)且(qie)要持久(jiu)，其中(zhong)任何一(yi)(yi)(yi)種血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)抗體(ti)的(de)(de)(de)(de)消減(jian)(jian)都有發(fa)(fa)生DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)可(ke)能。流行(xing)病(bing)學資料(liao)表明，DEN幾個血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)感(gan)染(ran)人的(de)(de)(de)(de)概(gai)率(lv)是不(bu)同的(de)(de)(de)(de)，其中(zhong)以(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)2的(de)(de)(de)(de)感(gan)染(ran)概(gai)率(lv)最高(gao)，所(suo)以(yi)由其它(ta)(ta)幾種血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)病(bing)毒(du)誘(you)發(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反應(ying)很易識(shi)別DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)毒(du)，由此DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)毒(du)誘(you)發(fa)(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)概(gai)率(lv)明顯大于DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4；另(ling)外DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)毒(du)誘(you)導的(de)(de)(de)(de)特(te)異免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)力(li)又(you)明顯弱于其它(ta)(ta)3型(xing)(xing)，所(suo)以(yi)制備以(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)2為基礎的(de)(de)(de)(de)4價疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗和(he)傳(chuan)統(tong)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗比較，減(jian)(jian)少了DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4的(de)(de)(de)(de)4種血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)NS3蛋白誘(you)發(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)交叉(cha)(cha)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反應(ying)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)干擾作(zuo)(zuo)用，減(jian)(jian)少了DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)可(ke)能，同時又(you)能有效而(er)持久(jiu)地(di)誘(you)導機體(ti)產(chan)生針(zhen)對4種血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)反應(ying)，從(cong)而(er)起到預防作(zuo)(zuo)用。
克(ke)(ke)隆(long)法 嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)獲得(de)大(da)多(duo)是(shi)(shi)利用感染(ran)性(xing)(xing)克(ke)(ke)隆(long)技術(shu)，目前已有(you)部(bu)分黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)屬(shu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)獲得(de)了(le)感染(ran)性(xing)(xing)克(ke)(ke)隆(long)，如YFV、TBEV、Kunjin病(bing)(bing)(bing)毒(du)、墨累河(he)谷腦炎(yan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(MVE)、西尼羅(luo)河(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(WNV)、DEN4型(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)，這些克(ke)(ke)隆(long)包含有(you)病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)全部(bu)基(ji)因(yin)，能夠(gou)在(zai)宿主菌(jun)中穩定地(di)復制(zhi)和(he)傳(chuan)代，以作為種子批保(bao)存。當構(gou)建嵌(qian)(qian)合體(ti)(ti)時(shi)，在(zai)供(gong)體(ti)(ti)基(ji)因(yin)和(he)受(shou)體(ti)(ti)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)連接處，通過(guo)同(tong)義突變(bian)(bian)或(huo)者(zhe)保(bao)守突變(bian)(bian)，為受(shou)體(ti)(ti)株和(he)供(gong)體(ti)(ti)株基(ji)因(yin)組添加合適的(de)(de)(de)酶(mei)切位點(dian)，然后(hou)將(jiang)兩者(zhe)利用酶(mei)切位點(dian)連接起來，制(zhi)備嵌(qian)(qian)合性(xing)(xing)克(ke)(ke)隆(long)，體(ti)(ti)外經RNA聚合酶(mei)作用轉(zhuan)錄出嵌(qian)(qian)合性(xing)(xing)轉(zhuan)錄子，轉(zhuan)染(ran)細胞后(hou)重新(xin)獲得(de)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)毒(du)。這項技術(shu)的(de)(de)(de)一個優點(dian)在(zai)于(yu)在(zai)它是(shi)(shi)在(zai)cDNA水平(ping)上的(de)(de)(de)操作，突變(bian)(bian)率低、表型(xing)穩定，不像傳(chuan)統(tong)疫苗研制(zhi)過(guo)程中容易(yi)發(fa)生(sheng)一系(xi)列(lie)的(de)(de)(de)生(sheng)物特性(xing)(xing)改(gai)變(bian)(bian)。
克隆法
融(rong)合(he)(he)(he)(he)PCR 利用PCR技術(shu)制(zhi)備(bei)嵌合(he)(he)(he)(he)病(bing)毒(du)最大的(de)(de)優(you)點在(zai)(zai)于方便快(kuai)捷，過去(qu)幾個(ge)(ge)月的(de)(de)工作現在(zai)(zai)幾天就能(neng)完(wan)成。目前生物技術(shu)產品日臻完(wan)善，不(bu)少公司推出高保真、熱(re)穩定(ding)性好的(de)(de)逆轉(zhuan)錄酶和(he)DNA聚合(he)(he)(he)(he)酶，如(ru)(ru)SuperscriptII逆轉(zhuan)錄酶、LAro~酶、Exraq酶、ExpandlongtemplatePCR聚合(he)(he)(he)(he)酶系(xi)統等，利用這些酶可以(yi)有(you)效(xiao)地擴增出病(bing)毒(du)基(ji)因(yin)組大片(pian)段(duan)(>5kh)甚至全長(chang)的(de)(de)cDNA。用4條引物、3次PCR可以(yi)把兩(liang)個(ge)(ge)異質基(ji)因(yin)片(pian)段(duan)連接在(zai)(zai)一起。另(ling)有(you)報道利用3個(ge)(ge)引物、兩(liang)次PCR即可制(zhi)備(bei)嵌合(he)(he)(he)(he)基(ji)因(yin)，如(ru)(ru)YF—MOD嵌合(he)(he)(he)(he)病(bing)毒(du)。
融合PCR
與克隆技術相比較(jiao)，PCR方法更為靈活，可(ke)以(yi)選擇任(ren)意位置進行嵌合；但(dan)是PCR具有一定的突變率，可(ke)能會帶來一些(xie)致死性突變而(er)(er)使轉錄(lu)體(ti)不具有感染性，得不到恢復病(bing)毒從而(er)(er)前功(gong)盡棄(qi)，所(suo)以(yi)現在大多數實(shi)驗(yan)還是采取(qu)克隆法。
滅活(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)之間的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)重(zhong)組 是(shi)將(jiang)(jiang)兩種或者(zhe)兩種以上的(de)(de)滅活(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)，在同一細胞內培養后，它們之間發生基(ji)(ji)因(yin)(yin)重(zhong)組，有時(shi)會產生感染性(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)，這(zhe)種方(fang)法又(you)稱為多(duo)重(zhong)復合(he)(he)，可能由(you)于(yu)滅活(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)受損的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)經重(zhong)組后得(de)(de)以替補。如為了解(jie)包(bao)膜病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)融(rong)(rong)(rong)合(he)(he)活(huo)性(xing)(xing)，利用黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)YF一17DD和(he)流感病(bing)(bing)(bing)毒(du)X31兩者(zhe)不(bu)同的(de)(de)融(rong)(rong)(rong)合(he)(he)條件(jian)，以及核衣(yi)殼不(bu)同的(de)(de)形(xing)態，將(jiang)(jiang)YF一17DD通(tong)過酸處(chu)(chu)理失去融(rong)(rong)(rong)合(he)(he)活(huo)性(xing)(xing)，X31通(tong)過熱處(chu)(chu)理滅活(huo)，兩者(zhe)在YF一17DD滅活(huo)的(de)(de)同一pH值下發生融(rong)(rong)(rong)和(he)反(fan)應(ying)(ying)，只有發生融(rong)(rong)(rong)和(he)反(fan)應(ying)(ying)的(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)具(ju)有感染性(xing)(xing)；流感病(bing)(bing)(bing)毒(du)提供(gong)功(gong)能型膜蛋白(bai)融(rong)(rong)(rong)合(he)(he)成(cheng)分，YF一17DD提供(gong)功(gong)能基(ji)(ji)因(yin)(yin)組，結(jie)果兩個滅活(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)又(you)重(zhong)新(xin)構建成(cheng)新(xin)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)。這(zhe)項技術隨機(ji)性(xing)(xing)很大，但是(shi)可能得(de)(de)到(dao)意想(xiang)不(bu)到(dao)的(de)(de)結(jie)果，可以用于(yu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)功(gong)能的(de)(de)研(yan)究。
黃熱(re)病(bing)毒嵌(qian)合病(bing)毒的構建前提在于，所有(you)的黃熱(re)病(bing)毒的病(bing)毒基(ji)因組(zu)的結構是(shi)高度保守(shou)的，它們均為(wei)(wei)單股正鏈RNA病(bing)毒，基(ji)因組(zu)全(quan)長(chang)約l1kb，5端(duan)有(you)帽子結構，3端(duan)無poly(A)尾(wei)，一個(ge)長(chang)的開放(fang)閱讀框架(jia)覆蓋了大(da)部分基(ji)因組(zu)，共編碼(ma)3個(ge)結構蛋(dan)白和(he)7個(ge)非結構蛋(dan)白，其(qi)中(zhong)以(yi)E蛋(dan)白和(he)免疫原性(xing)關系(xi)最為(wei)(wei)密切(qie)，所以(yi)構建的嵌(qian)合病(bing)毒一般都要(yao)(yao)取供體(ti)病(bing)毒的E基(ji)因；但并不是(shi)所有(you)構建的嵌(qian)合性(xing)cDNA克隆都具有(you)感染(ran)性(xing)，其(qi)主要(yao)(yao)影響因素如下。
技術方面 雖然現在工具(ju)酶的保真性(xing)和效率越來越好，但是黃熱病(bing)毒長(chang)10kb以(yi)上(shang)，在基因操作中不可避免(mian)有(you)突變的發生(sheng)，而有(you)些(xie)突變是致死性(xing)突變，使(shi)得構建的全長(chang)cDNA克隆或者(zhe)嵌合體(ti)克隆沒有(you)感染性(xing)。另外(wai)這些(xie)突變還影響恢復病(bing)毒的生(sheng)物學特性(xing)，如溫(wen)度(du)敏感性(xing)、噬(shi)斑大小、復制能力、嗜細胞能力都可能發生(sheng)改變。
技術方面
嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)位點(dian) 結構(gou)蛋白基因(yin)之(zhi)間(jian)的(de)(de)連接(jie)處有(you)一(yi)段(duan)親脂區序(xu)(xu)列(lie)，是(shi)構(gou)建嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)時將(jiang)兩段(duan)異(yi)質核苷(gan)酸序(xu)(xu)列(lie)進(jin)行(xing)連接(jie)的(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)位點(dian)處，這一(yi)段(duan)序(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)保守(shou)性(xing)對于(yu)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)的(de)(de)復(fu)制能(neng)力至關重(zhong)要。如在(zai)prM和(he)(he)C基因(yin)之(zhi)間(jian)有(you)信號肽酶(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)(ge)位點(dian)以及(ji)蛋白酶(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)(ge)位點(dian)，Cau—four等在(zai)構(gou)建YF17D—DEN2嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)時選擇這兩處作為(wei)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)位點(dian)，結果在(zai)信號肽酶(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)(ge)位點(dian)處嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)的(de)(de)病(bing)毒(du)有(you)感染性(xing)，而(er)在(zai)蛋白酶(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)(ge)位點(dian)處進(jin)行(xing)連接(jie)無法獲得病(bing)毒(du)，因(yin)為(wei)在(zai)兩個(ge)位點(dian)之(zhi)間(jian)有(you)一(yi)段(duan)親脂性(xing)的(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)膜區，YFv這一(yi)區域(yu)比DEN一(yi)2該(gai)區域(yu)要多6個(ge)氨(an)基酸；在(zai)蛋白酶(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)(ge)位點(dian)處構(gou)建的(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)體，由于(yu)這一(yi)轉(zhuan)(zhuan)膜區缺少了(le)6個(ge)氨(an)基酸，蛋白酶(mei)(mei)和(he)(he)信號肽酶(mei)(mei)不能(neng)正確識別切(qie)割(ge)(ge)(ge)位點(dian)，從而(er)影響prM蛋白和(he)(he)E蛋白的(de)(de)成熟，病(bing)毒(du)的(de)(de)復(fu)制過程受到阻礙(ai)，病(bing)毒(du)顆(ke)粒沒法進(jin)行(xing)正常的(de)(de)包裝，所以無法分泌(mi)出病(bing)毒(du)顆(ke)粒。
嵌合位點
供(gong)體病毒基(ji)(ji)因(yin) 目前構建的(de)(de)嵌合病毒多為供(gong)體株(zhu)提供(gong)P和E基(ji)(ji)因(yin)，人們(men)也(ye)嘗試(shi)過(guo)替代C基(ji)(ji)因(yin)或者部分基(ji)(ji)因(yin)，但(dan)多數沒有成功，其可能的(de)(de)原(yuan)因(yin)是位(wei)于C蛋白(bai)(bai)區域的(de)(de)保守序列與受體株(zhu)病毒順式結構不(bu)(bu)相容(rong)性，進而對(dui)嵌合病毒RNA的(de)(de)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)產(chan)生(sheng)了毒性，如Kuniin病毒RNA復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)必(bi)須有同源C蛋白(bai)(bai)上的(de)(de)第2位(wei)和第20位(wei)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)的(de)(de)存(cun)，而異質基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)C蛋白(bai)(bai)不(bu)(bu)能協助(zhu)Kunjin病毒復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)，所以無法長成病毒顆(ke)粒；另外也(ye)可能是異質病毒之間的(de)(de)蛋白(bai)(bai)酶識別對(dui)方序列的(de)(de)能力低(di)下，對(dui)于C—prM部位(wei)的(de)(de)切割效(xiao)率低(di)，影響病毒正常的(de)(de)裝配和釋放能力。
供體病毒
受(shou)體病(bing)(bing)毒(du)(du)基(ji)(ji)因 作為(wei)(wei)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)載(zai)體，嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)中(zhong)的(de)大部分(fen)基(ji)(ji)因由(you)(you)(you)受(shou)體株(zhu)提供(gong)，嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)復(fu)制(zhi)特性(xing)也主要由(you)(you)(you)受(shou)體株(zhu)的(de)基(ji)(ji)因控制(zhi)，其(qi)中(zhong)有(you)(you)些序列(lie)對(dui)于嵌合體的(de)感染(ran)性(xing)有(you)(you)決定性(xing)作用，在構建(jian)(jian)嵌合體時，如果這(zhe)部分(fen)序列(lie)受(shou)到破壞，就不能夠獲(huo)得恢(hui)復(fu)病(bing)(bing)毒(du)(du)。如在構建(jian)(jian)DEN一4和(he)(he)WNV的(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)時四(si)，由(you)(you)(you)WNVNY99的(de)prM和(he)(he)E基(ji)(ji)因代替DEN一4相應位(wei)置的(de)基(ji)(ji)因，在構建(jian)(jian)的(de)18個(ge)克(ke)隆中(zhong)僅有(you)(you)兩個(ge)具(ju)有(you)(you)感染(ran)性(xing)，序列(lie)比較發現這(zhe)兩個(ge)克(ke)隆在prM和(he)(he)C蛋白之間的(de)NS2A—NS2B蛋白酶切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)(dian)下游，在轉膜信號(hao)區(qu)域中(zhong)都包含一基(ji)(ji)序，這(zhe)一基(ji)(ji)序是(shi)酶切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)(dian)下游的(de)第(di)(di)3位(wei)及第(di)(di)6位(wei)分(fen)別為(wei)(wei)天冬氨(an)酸(suan)和(he)(he)蘇氨(an)酸(suan)，另外16個(ge)克(ke)隆則沒有(you)(you)該位(wei)點(dian)(dian)，實(shi)驗表明這(zhe)兩個(ge)位(wei)點(dian)(dian)似乎和(he)(he)嵌合性(xing)克(ke)隆的(de)感染(ran)性(xing)有(you)(you)關。
受體病毒
嵌合(he)(he)病毒的(de)(de)一個最(zui)大特點(dian)是表型多發生變(bian)化，如復制能力(li)、毒力(li)、抗原(yuan)性等，可能的(de)(de)原(yuan)因是由于缺乏校正功能的(de)(de)聚合(he)(he)酶(mei)存在(zai)，而(er)有異質基因的(de)(de)正鏈RNA病毒，在(zai)病毒復制中具有較高的(de)(de)基因突變(bian)率，并且這(zhe)些突變(bian)為了適應不同的(de)(de)宿主細胞，可能會發生一些特性改變(bian)，從而(er)出現(xian)一些預(yu)想不到的(de)(de)結果。
生(sheng)長特(te)性改(gai)(gai)變 嵌合病(bing)(bing)毒的(de)兩(liang)個母體病(bing)(bing)毒的(de)易感細胞不(bu)同，得到的(de)嵌合病(bing)(bing)毒在不(bu)同細胞中復制(zhi)時，由于缺乏有(you)效(xiao)的(de)復制(zhi)酶而(er)引(yin)起(qi)生(sheng)長特(te)性的(de)改(gai)(gai)變，其嗜細胞性也會有(you)所改(gai)(gai)變，另外噬斑試驗中噬斑形態
生長特性改變
大小(xiao)都(dou)多有變化。如Chimeri—JE嵌(qian)合體在(zai)(zai)Vero、LLC—MK，、C6/36細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)復(fu)制(zhi)(zhi)形(xing)式類似，而在(zai)(zai)MRC一5、FRhl細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)雖(sui)然病(bing)(bing)毒(du)滴度能(neng)(neng)夠(gou)達到6log。0pfu/mL，但是(shi)卻不(bu)能(neng)(neng)產生CPE，這些特性和(he)母體株YFV以及JEV都(dou)截然不(bu)同(tong)。LGT1和(he)E5是(shi)TBEV的(de)(de)兩個弱毒(du)株，與DEN一4病(bing)(bing)毒(du)組(zu)成(cheng)的(de)(de)嵌(qian)合體在(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)復(fu)制(zhi)(zhi)能(neng)(neng)力(li)下降，而轉染蚊蟲(chong)細(xi)(xi)胞(bao)復(fu)制(zhi)(zhi)能(neng)(neng)力(li)不(bu)受影響，用(yong)在(zai)(zai)蚊蟲(chong)細(xi)(xi)胞(bao)傳代的(de)(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)在(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)(xi)胞(bao)LLC—MK2中(zhong)(zhong)不(bu)能(neng)(neng)夠(gou)形(xing)成(cheng)噬斑，而在(zai)(zai)早期構(gou)建的(de)(de)DEN一4和(he)另一個TBEV病(bing)(bing)毒(du)株構(gou)建的(de)(de)嵌(qian)合體在(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)卻能(neng)(neng)夠(gou)得到比DEN一4病(bing)(bing)毒(du)滴度高1000倍的(de)(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)。
神經(jing)內(nei)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)(he)神經(jing)外毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing) 神經(jing)內(nei)(外)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)低而免(mian)疫(yi)原性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)好是一(yi)(yi)(yi)個理(li)想(xiang)疫(yi)苗應具備的(de)(de)(de)品質，許多實驗室(shi)經(jing)過多年研(yan)究(jiu)雖然(ran)篩檢出一(yi)(yi)(yi)些減(jian)毒(du)株(zhu)(zhu)(zhu)，但是兩者(zhe)多不能達到(dao)有效的(de)(de)(de)統一(yi)(yi)(yi)。嵌(qian)(qian)(qian)合病(bing)毒(du)技術以“取長補短”的(de)(de)(de)原則，將兩種病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)原性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)(he)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)結合起來(lai)，以期研(yan)制理(li)想(xiang)疫(yi)苗，就目前得(de)到(dao)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)些嵌(qian)(qian)(qian)合株(zhu)(zhu)(zhu)來(lai)說，確(que)實取得(de)了(le)一(yi)(yi)(yi)些令人(ren)滿意的(de)(de)(de)結果，如DEN一(yi)(yi)(yi)4和(he)(he)WNV的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)合病(bing)毒(du)與WNV相比高度(du)減(jian)毒(du)四(si)，腦內(nei)接種戒奶小(xiao)鼠，神經(jing)內(nei)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)降(jiang)低至(zhi)1/28500；腹腔(qiang)內(nei)接種小(xiao)鼠，神經(jing)外毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)下(xia)降(jiang)至(zhi)1/10000，免(mian)疫(yi)原性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)好，能安全(quan)保護小(xiao)鼠接受野生株(zhu)(zhu)(zhu)攻擊。另外如ChimeriVax—JE嵌(qian)(qian)(qian)合病(bing)毒(du)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)也較母體株(zhu)(zhu)(zhu)YFV和(he)(he)JEV呈大幅度(du)下(xia)降(jiang)，而單劑量又具備很好的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)保護力；還有DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等嵌(qian)(qian)(qian)合病(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)都有所下(xia)降(jiang)，這些嵌(qian)(qian)(qian)合體都在進一(yi)(yi)(yi)步的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)中。
神(shen)經(jing)內毒(du)性和神(shen)經(jing)外毒(du)性
基(ji)因(yin)穩定(ding)(ding)性(xing) 因(yin)為(wei)(wei)RNA病毒(du)(du)易以(yi)準(zhun)種的(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)式出(chu)現(xian)和(he)易變(bian)異(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)特性(xing)，作為(wei)(wei)活(huo)疫苗來使用，一(yi)(yi)個重要的(de)(de)(de)(de)(de)條件是(shi)基(ji)因(yin)型(xing)要穩定(ding)(ding)，這一(yi)(yi)點是(shi)疫苗安全性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)重要表現(xian)。嵌合(he)病毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)穩定(ding)(ding)性(xing)主(zhu)要通過返祖實(shi)驗檢定(ding)(ding)，即在(zai)(zai)乳(ru)(ru)鼠腦(nao)(nao)內和(he)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中進(jin)行(xing)培(pei)養，觀察有(you)無明(ming)顯表型(xing)變(bian)化，必要時(shi)進(jin)行(xing)核苷酸鑒定(ding)(ding)，如ChimeriVax-JE嵌合(he)病毒(du)(du)115．161在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內傳代(dai)l8次(ci)以(yi)及在(zai)(zai)乳(ru)(ru)鼠腦(nao)(nao)內傳代(dai)6次(ci)并沒有(you)毒(du)(du)力的(de)(de)(de)(de)(de)回(hui)升，對減毒(du)(du)位(wei)點進(jin)行(xing)測序也沒有(you)發生核苷酸改變(bian)。而有(you)的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病毒(du)(du)穩定(ding)(ding)性(xing)不夠好如DEN一(yi)(yi)2/DEN一(yi)(yi)4、DEN一(yi)(yi)2/DEN—l復(fu)(fu)制能力較弱，而經過幾次(ci)傳代(dai)后(hou)得到較高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)病毒(du)(du)滴度，是(shi)因(yin)為(wei)(wei)發生了(le)一(yi)(yi)些突(tu)變(bian)。在(zai)(zai)體(ti)外(wai)轉(zhuan)錄時(shi)產生了(le)轉(zhuan)錄體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)雜(za)和(he)體(ti)，在(zai)(zai)轉(zhuan)染(ran)后(hou)經過細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)復(fu)(fu)制，復(fu)(fu)制能力增(zeng)強的(de)(de)(de)(de)(de)病毒(du)(du)逐漸占主(zhu)要優勢，在(zai)(zai)LLC—MK2細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中病毒(du)(du)傳代(dai)可以(yi)保持較高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)遺傳穩定(ding)(ding)性(xing)，所以(yi)在(zai)(zai)制備嵌合(he)疫苗時(shi)，應盡量(liang)減少病毒(du)(du)在(zai)(zai)哺乳(ru)(ru)動物細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中傳代(dai)的(de)(de)(de)(de)(de)次(ci)數(shu)。
基因穩定性
在黃熱(re)病(bing)毒(du)嵌(qian)合病(bing)毒(du)發(fa)展的(de)這十幾年中，人們嘗試(shi)構(gou)建了多種嵌(qian)合病(bing)毒(du)，其中大部分(fen)是以(yi)制備(bei)疫苗(miao)為目的(de)，另外還(huan)用于病(bing)毒(du)的(de)分(fen)子生(sheng)物學(xue)特性研究。
分子生物(wu)學特性(xing)研究 型(xing)(xing)內嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)可(ke)以(yi)用(yong)于了解病(bing)(bing)(bing)毒(du)復制(zhi)(zhi)(zhi)能(neng)力(li)(li)，進一(yi)步了解各(ge)基(ji)因的(de)(de)(de)功能(neng)。如構建同型(xing)(xing)不同株(zhu)(zhu)(zhu)之(zhi)間DEN一(yi)216681/PDK一(yi)53、DEN25ol/04株(zhu)(zhu)(zhu)之(zhi)間的(de)(de)(de)型(xing)(xing)內嵌合疫(yi)(yi)苗，研究DEN一(yi)2型(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)結構蛋(dan)白(bai)區對(dui)乳鼠(shu)神經毒(du)性(xing)的(de)(de)(de)影響。可(ke)以(yi)用(yong)于推測病(bing)(bing)(bing)毒(du)毒(du)力(li)(li)位點，由2個(ge)JEV病(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)(zhu)cDNA克隆提供(gong)5端，3個(ge)病(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)(zhu)cDNA提供(gong)的(de)(de)(de)3端進行組(zu)(zu)合，感(gan)染細胞(bao)(bao)后重(zhong)新獲得(de)6種(zhong)重(zhong)組(zu)(zu)JEV病(bing)(bing)(bing)毒(du)。根據(ju)噬菌斑大(da)小篩選到(dao)3個(ge)減毒(du)株(zhu)(zhu)(zhu)，比較(jiao)6種(zhong)重(zhong)組(zu)(zu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)(zhu)和(he)野生株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)基(ji)因序列，發現僅僅是E138(Glu—Lys)一(yi)個(ge)氨基(ji)酸位點不同，說明這(zhe)個(ge)位點和(he)毒(du)力(li)(li)之(zhi)間關系密切；另(ling)外發現該突(tu)變(bian)株(zhu)(zhu)(zhu)雖(sui)然毒(du)性(xing)降(jiang)低(di)，但是腦(nao)內注射接(jie)種(zhong)小鼠(shu)后仍能(neng)在(zai)(zai)腦(nao)內復制(zhi)(zhi)(zhi)，但是病(bing)(bing)(bing)毒(du)滴度(du)比較(jiao)低(di)，看來其減毒(du)機制(zhi)(zhi)(zhi)不在(zai)(zai)于病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)復制(zhi)(zhi)(zhi)，而可(ke)能(neng)是影響復制(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)早期機制(zhi)(zhi)(zhi)，在(zai)(zai)細胞(bao)(bao)之(zhi)間傳遞速(su)度(du)比較(jiao)慢，從而使免疫(yi)(yi)系統能(neng)及時(shi)清除病(bing)(bing)(bing)毒(du)。
分子生物學特性研究
型間嵌合病(bing)(bing)毒(du)也(ye)(ye)可以用于分子生(sheng)物(wu)學(xue)特(te)性(xing)(xing)的(de)研究，如黃(huang)熱病(bing)(bing)毒(du)和(he)(he)(he)日本(ben)腦(nao)炎病(bing)(bing)毒(du)雖(sui)然(ran)同(tong)(tong)屬黃(huang)熱病(bing)(bing)毒(du)屬，但是(shi)(shi)有(you)很(hen)多生(sheng)物(wu)學(xue)特(te)性(xing)(xing)都不(bu)盡相(xiang)同(tong)(tong)，如抗原性(xing)(xing)相(xiang)差(cha)很(hen)遠、中間宿主(zhu)不(bu)同(tong)(tong)、引(yin)起人體(ti)(ti)發病(bing)(bing)的(de)癥狀(zhuang)也(ye)(ye)截然(ran)不(bu)同(tong)(tong)；兩者雖(sui)然(ran)從同(tong)(tong)一病(bing)(bing)毒(du)得來(lai)，但是(shi)(shi)在(zai)進化的(de)過程中發生(sheng)了很(hen)大的(de)變化，構(gou)建的(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)YF/JE(S)其(qi)生(sheng)物(wu)學(xue)特(te)性(xing)(xing)也(ye)(ye)有(you)所改變，如神(shen)經(jing)內毒(du)性(xing)(xing)和(he)(he)(he)神(shen)經(jing)外毒(du)性(xing)(xing)都有(you)所降低(di)，和(he)(he)(he)其(qi)供(gong)體(ti)(ti)株SAl4一l4—2相(xiang)似；而(er)構(gou)建的(de)另一個(ge)嵌合株YF/JE(N)神(shen)經(jing)毒(du)性(xing)(xing)卻很(hen)高(gao)，和(he)(he)(he)供(gong)體(ti)(ti)株Nakayama特(te)性(xing)(xing)一致；這說明確實如原先預料(liao)，和(he)(he)(he)減(jian)毒(du)有(you)關的(de)表位主(zhu)要存(cun)在(zai)E蛋(dan)白(bai)(bai)中，而(er)同(tong)(tong)時也(ye)(ye)發現，和(he)(he)(he)原來(lai)的(de)SA14-14-2相(xiang)比較，嵌合株在(zai)細胞中復制能力升高(gao)，病(bing)(bing)毒(du)滴度較高(gao)，免疫原性(xing)(xing)增加(jia)，這又說明是(shi)(shi)YF一17DD病(bing)(bing)毒(du)的(de)非結構(gou)蛋(dan)白(bai)(bai)發揮作用。
候(hou)選疫苗(miao) ChimeriVax-JE嵌合病毒(du)
候選疫苗
日(ri)本(ben)腦(nao)炎是(shi)一種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)影響中樞神(shen)經(jing)系統的(de)(de)疾病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)，主要流行于亞(ya)洲(zhou)(zhou)(zhou)，但是(shi)近年(nian)在澳(ao)洲(zhou)(zhou)(zhou)、美(mei)洲(zhou)(zhou)(zhou)也有(you)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)例發(fa)生，每(mei)年(nian)官方報道全球有(you)5萬病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)例，其(qi)中有(you)l萬例是(shi)致死性的(de)(de)；雖然目前有(you)活(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗、滅活(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗的(de)(de)使用，但是(shi)這些疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗具(ju)有(you)免疫(yi)(yi)(yi)(yi)原性不夠、價格(ge)偏高、制作工藝(yi)不被(bei)WHO認可等(deng)劣勢(shi)，所以還(huan)有(you)必要開發(fa)研制新疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗。1999年(nian)Chambers等(deng)以SA14-14-2的(de)(de)prM和E基(ji)因代替YF一17DD疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗株(zhu)(zhu)的(de)(de)相(xiang)應基(ji)因構建了嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)ChimeriVax—JE15,16,，該病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)能(neng)在WHO認可的(de)(de)細胞中很好地被(bei)培養，恢復病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)和YF一17DD、SA14—14-2相(xiang)比較，以6log0pfu的(de)(de)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)腦(nao)內接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)3-4周齡小(xiao)鼠無一例發(fa)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)，而接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)YF-17DD的(de)(de)小(xiao)鼠全部死亡；另外用3．2log0pfu劑量的(de)(de)SA14-14-2接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，能(neng)在85%一95%的(de)(de)接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)者中產生中和抗(kang)體，抗(kang)體平均滴(di)度能(neng)夠達到PRNT~o<30，血清陽轉率(lv)小(xiao)于80%；而接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)4~51og0pfu的(de)(de)嵌(qian)(qian)合疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗后，能(neng)夠達到100%的(de)(de)血清陽轉率(lv)，接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)后30dPRNT能(neng)夠達到129~327，這些結果表明(ming)構建的(de)(de)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)神(shen)經(jing)內毒(du)(du)性呈大幅度降低(di)；用乳鼠以及猴(hou)子(zi)進(jin)行安全試(shi)驗檢(jian)測(ce)，進(jin)一步證實了該病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)弱神(shen)經(jing)毒(du)(du)性，內臟毒(du)(du)性也下降。目前該疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗已經(jing)通過一期臨床(chuang)試(shi)驗，是(shi)很有(you)前途的(de)(de)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗候(hou)選株(zhu)(zhu)。
登革病毒多價疫苗
登革(ge)病(bing)毒(du)是目前誘發疾病(bing)最多的(de)(de)(de)(de)(de)黃熱(re)病(bing)毒(du)，在(zai)人口聚集的(de)(de)(de)(de)(de)熱(re)帶(dai)及亞(ya)熱(re)帶(dai)時有(you)(you)爆發，因為(wei)登革(ge)病(bing)毒(du)4個(ge)血(xue)清型之間可(ke)以(yi)產生(sheng)交叉保護力(li)，所(suo)以(yi)感(gan)染一(yi)種(zhong)病(bing)毒(du)后(hou)，能(neng)夠對(dui)另外3種(zhong)血(xue)清型病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)(de)抗體(ti)反(fan)應。在(zai)機(ji)體(ti)遭受(shou)(shou)另一(yi)種(zhong)血(xue)清型病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)(de)感(gan)染后(hou)，由(you)于抗體(ti)依賴的(de)(de)(de)(de)(de)復(fu)制能(neng)力(li)增強作用可(ke)能(neng)誘發DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)發生(sheng)，因此理想(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)疫(yi)苗應該能(neng)夠產生(sheng)針對(dui)4個(ge)型病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)(de)中和(he)抗體(ti)和(he)T細胞(bao)免(mian)疫(yi)。目前主要有(you)(you)兩個(ge)實驗(yan)室(shi)分別以(yi)DEN一(yi)2PDK一(yi)53和(he)YF一(yi)17DD作為(wei)受(shou)(shou)體(ti)株構建了包括DEN一(yi)1到DEN-4型的(de)(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合株，結果有(you)(you)很好的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)原(yuan)性(xing)(xing)、較(jiao)高的(de)(de)(de)(de)(de)復(fu)制效率和(he)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)，在(zai)動物實驗(yan)中證明毒(du)性(xing)(xing)減低，小鼠效力(li)實驗(yan)安全有(you)(you)效，有(you)(you)望成為(wei)登革(ge)病(bing)毒(du)疫(yi)苗的(de)(de)(de)(de)(de)發展方向。
另(ling)外還有YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)(de)報(bao)道(dao)，都出現(xian)一些令人滿意的(de)(de)特性(xing)，進(jin)一步研究(jiu)正(zheng)在(zai)(zai)進(jin)行中。嵌合病毒(du)(du)(du)的(de)(de)出現(xian)是獲得減(jian)毒(du)(du)(du)活疫苗的(de)(de)一個新途徑，和傳統方法相比具有目標明(ming)確、免(mian)疫效果(guo)好(hao)、減(jian)毒(du)(du)(du)穩定的(de)(de)優(you)勢，但(dan)該(gai)技術目前還處(chu)于探索階段(duan)，有時結果(guo)很出人意料，所(suo)以在(zai)(zai)構建(jian)一個新的(de)(de)嵌合體(ti)時，要時刻注意安全性(xing)問題，否則(ze)會適得其反，創造出新的(de)(de)毒(du)(du)(du)性(xing)更強的(de)(de)病毒(du)(du)(du)，為人類帶(dai)來危害。
嵌(qian)合疫(yi)苗(miao)是應用(yong)(yong)基因(yin)工程手段構建基因(yin)能表(biao)達兩(liang)種(zhong)以上病(bing)(bing)原體抗原的一(yi)類新型疫(yi)苗(miao),應用(yong)(yong)嵌(qian)合疫(yi)苗(miao)可解決多次接種(zhong)問題。本文綜述了目前世界一(yi)些國家研(yan)制的嵌(qian)合疫(yi)苗(miao),如(ru)登革病(bing)(bing)毒、乙型腦(nao)炎(yan)病(bing)(bing)毒、呼吸道合胞(bao)病(bing)(bing)毒、副流感(gan)病(bing)(bing)毒、人類免(mian)疫(yi)缺陷(xian)病(bing)(bing)病(bing)(bing)毒及人乳頭(tou)瘤(liu)病(bing)(bing)毒等(deng)相關嵌(qian)合疫(yi)苗(miao)的研(yan)究策略和方(fang)法、免(mian)疫(yi)學(xue)評價及其應用(yong)(yong)前景。
精靈世(shi)界
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