黃熱(re)(re)(re)病(bing)(bing)毒(du)(du)屬(1qav/virus)包含80多個成(cheng)員,屬于正鏈RNA病(bing)(bing)毒(du)(du),其中半數以上(shang)的病(bing)(bing)毒(du)(du)能(neng)夠誘(you)發人(ren)和動物產生疾(ji)病(bing)(bing),患病(bing)(bing)率高而治愈率低,容易留下一(yi)些(xie)嚴重的后(hou)遺癥,給(gei)人(ren)類健康帶來很(hen)大(da)威脅(xie),如流(liu)行(xing)性(xing)乙型腦炎病(bing)(bing)毒(du)(du)(JEV)、登革熱(re)(re)(re)病(bing)(bing)病(bing)(bing)毒(du)(du)(DEN)、黃熱(re)(re)(re)病(bing)(bing)毒(du)(du)(YFV)、蜱傳腦炎病(bing)(bing)毒(du)(du)(TBEV)等。一(yi)直(zhi)以來人(ren)們對RNA病(bing)(bing)毒(du)(du)的了(le)解都比較缺乏,無論是分子(zi)水(shui)平上(shang)的機理研究,還是宏觀上(shang)疫苗(miao)的研制、藥物的開發,其進(jin)展都非(fei)常(chang)緩慢(man)。
嵌合病(bing)毒(du)(du)是一種(zhong)基因工程(cheng)重組(zu)病(bing)毒(du)(du),在制備技術上并不存(cun)在太大問題(ti),但(dan)作(zuo)為重組(zu)病(bing)毒(du)(du),在安(an)全(quan)性(xing)(xing)上還有(you)一定的(de)風險(xian),在自然條件下,有(you)病(bing)毒(du)(du)之間自發產生(sheng)重組(zu)的(de)例子,可能獲(huo)得一些(xie)意想不到的(de)新(xin)型(xing)病(bing)毒(du)(du),比母體株毒(du)(du)力更強,對生(sheng)物(wu)體更具有(you)威脅(xie)性(xing)(xing)。所以在制備嵌合病(bing)毒(du)(du)時(shi),要采用(yong)(yong)已知(zhi)特(te)性(xing)(xing)的(de)病(bing)毒(du)(du)株作(zuo)為嵌合病(bing)毒(du)(du)的(de)骨架(jia)結構,特(te)別是多選用(yong)(yong)減毒(du)(du)株作(zuo)為載體病(bing)毒(du)(du)目前黃熱病(bing)毒(du)(du)的(de)嵌合病(bing)毒(du)(du)采用(yong)(yong)的(de)載體主要有(you)以下幾種(zhong)。
YF一(yi)(yi)(yi)17DD 疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)株(zhu) YF一(yi)(yi)(yi)17DD是目前預防(fang)黃(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)感(gan)(gan)染(ran)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)株(zhu)減毒(du)(du)(du)活疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)】,始用于1936年(nian),在過(guo)(guo)去的(de)(de)(de)6O多(duo)年(nian)中(zhong),有超過(guo)(guo)3億(yi)人接(jie)種(zhong)過(guo)(guo)該(gai)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao),安全有效(xiao)。該(gai)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)株(zhu)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)原(yuan)性(xing)(xing)很好(hao),單劑量接(jie)種(zhong)后10d內(nei),近(jin)lo0%的(de)(de)(de)接(jie)種(zhong)者產生(sheng)中(zhong)和抗(kang)體(ti),免(mian)疫(yi)(yi)(yi)力持(chi)久甚至能夠維(wei)持(chi)終身。將YF一(yi)(yi)(yi)17DD疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)株(zhu)和原(yuan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)YF—Asibi進行序列比較后發現,該(gai)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)抗(kang)原(yuan)表位多(duo)集中(zhong)在E基因,構建(jian)(jian)(jian)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)多(duo)以這一(yi)(yi)(yi)段基因作(zuo)為(wei)靶基因。這樣構建(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)中(zhong),由YF一(yi)(yi)(yi)17DD株(zhu)保(bao)留的(de)(de)(de)NS蛋白基因只是誘(you)發針對該(gai)蛋白的(de)(de)(de)CTLs和非中(zhong)和性(xing)(xing)抗(kang)體(ti),而不(bu)具有交叉保(bao)護性(xing)(xing),所(suo)以嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)作(zuo)為(wei)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)使用時不(bu)會引起一(yi)(yi)(yi)般重組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)帶來(lai)的(de)(de)(de)抗(kang)載(zai)體(ti)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)反應,即使曾經接(jie)種(zhong)過(guo)(guo)YF一(yi)(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)接(jie)痘者再接(jie)種(zhong)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)也是安全有效(xiao)的(de)(de)(de),可以作(zuo)為(wei)一(yi)(yi)(yi)個理想的(de)(de)(de)活疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)株(zhu)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)載(zai)體(ti)。1989年(nian)Rice等(deng)151構建(jian)(jian)(jian)了YF一(yi)(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)感(gan)(gan)染(ran)性(xing)(xing)克隆,為(wei)構建(jian)(jian)(jian)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)提供了方便,目前文獻(xian)中(zhong)報道的(de)(de)(de)有關黃(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)嵌合株(zhu)多(duo)以此病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)作(zuo)為(wei)載(zai)體(ti)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。已經成功構建(jian)(jian)(jian)了包括(kuo)JEV、TBE、WNV、DEN等(deng)4個血(xue)清型病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)嵌合體(ti)。
YF一17DD 疫苗株
DEN一(yi)4變(bian)(bian)異株(zhu) 登革(ge)(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)分為(wei)(wei)(wei)4個血清型(xing)(xing),這4型(xing)(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)結(jie)構(gou)蛋白氨(an)基酸序列同源(yuan)性(xing)(xing)(xing)高達62%-74%,并且它們之間還有(you)(you)很好的(de)(de)交叉免疫原性(xing)(xing)(xing),一(yi)直以(yi)來(lai),人(ren)們試(shi)圖構(gou)建(jian)登革(ge)(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)4價疫苗,Bray等(deng)從1991年(nian)開始登革(ge)(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)研究,以(yi)DEN一(yi)4814669株(zhu)全(quan)長克(ke)隆作為(wei)(wei)(wei)載體(ti)(ti),構(gou)建(jian)了(le)包括DEN—l到(dao)DEN一(yi)3的(de)(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du),結(jie)果發現幾(ji)株(zhu)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)并沒(mei)有(you)(you)太大改變(bian)(bian),他們認(ren)為(wei)(wei)(wei)若能夠以(yi)一(yi)個毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)低的(de)(de)DEN-4病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)作為(wei)(wei)(wei)載體(ti)(ti)骨架,可(ke)能會使(shi)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)下降(jiang),由于3端(duan)和(he)5端(duan)非編(bian)碼區在(zai)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)復制中可(ke)能也起到(dao)調控作用,他們在(zai)構(gou)建(jian)的(de)(de)DEN一(yi)4感染性(xing)(xing)(xing)克(ke)隆的(de)(de)基礎上,刪除(chu)其3端(duan)和(he)5端(duan)非編(bian)碼區的(de)(de)部(bu)分序列,結(jie)果篩選(xuan)到(dao)一(yi)株(zhu)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu),其3端(duan)去(qu)掉(diao)了(le)3O個核(he)苷酸,毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)降(jiang)低但是免疫原性(xing)(xing)(xing)并沒(mei)有(you)(you)改變(bian)(bian)。用這個減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)作為(wei)(wei)(wei)載體(ti)(ti)和(he)其它3個血清型(xing)(xing)的(de)(de)登革(ge)(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)構(gou)成嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)后,果然有(you)(you)效(xiao)地(di)降(jiang)低了(le)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing);其后這個載體(ti)(ti)也用于構(gou)建(jian)黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)屬(shu)其他成員的(de)(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)。
DEN一4變異株
DEN一(yi)(yi)2 PDK一(yi)(yi)53減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu) 該(gai)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)也主(zhu)要是用于合(he)(he)成(cheng)登革病毒(du)(du)的(de)(de)(de)嵌合(he)(he)疫(yi)苗,2O世(shi)紀(ji)8O年代(dai)初期,泰國Mahidol實驗室將4種血清型(xing)的(de)(de)(de)登革病毒(du)(du)經過在(zai)細胞(bao)傳代(dai)中后獲得各自的(de)(de)(de)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu),其(qi)中以DEN一(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)53減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)減(jian)毒(du)(du)效果最好(hao),免疫(yi)保護(hu)力(li)(li)最強最持久。將該(gai)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)和野生(sheng)株(zhu)(zhu)進行(xing)比較,發現核苷酸水平上的(de)(de)(de)變異(yi)主(zhu)要在(zai)非(fei)結構區,說明該(gai)病毒(du)(du)株(zhu)(zhu)和毒(du)(du)力(li)(li)有(you)關的(de)(de)(de)基因可能在(zai)非(fei)結構區,而黃熱病毒(du)(du)屬(shu)其(qi)他成(cheng)員的(de)(de)(de)毒(du)(du)力(li)(li)基因多位(wei)于E蛋白(bai),這樣構建(jian)的(de)(de)(de)嵌合(he)(he)病毒(du)(du)減(jian)毒(du)(du)機制主(zhu)要由(you)供(gong)體株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)毒(du)(du)性(xing)起(qi)主(zhu)要因素,而由(you)DEN一(yi)(yi)2PDK-53減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)構建(jian)的(de)(de)(de)嵌合(he)(he)疫(yi)苗毒(du)(du)性(xing)的(de)(de)(de)減(jian)弱由(you)供(gong)體和受體共同(tong)決定(ding),更(geng)有(you)利于減(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)獲得
DEN一(yi)2 PDK一(yi)53減毒株
DEN一(yi)(yi)(yi)2減毒(du)(du)株作為(wei)嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)載(zai)體還有另(ling)外一(yi)(yi)(yi)個(ge)好(hao)處,登革(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)4個(ge)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)之(zhi)(zhi)間產生(sheng)交(jiao)叉免疫(yi)(yi)力(li),所以(yi)異型(xing)(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)二次(ci)感(gan)染(ran)由(you)于抗體依賴的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增強作用(yong)可(ke)以(yi)導(dao)(dao)(dao)致(zhi)登革(ge)出(chu)血(xue)(xue)熱/登革(ge)熱休克綜合征(DHF/DSS)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)生(sheng),理想的(de)(de)(de)(de)(de)(de)登革(ge)4價(jia)(jia)疫(yi)(yi)苗誘(you)導(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)力(li)要(yao)(yao)針(zhen)對4種(zhong)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du),有效而且(qie)要(yao)(yao)持久(jiu),其(qi)中任何一(yi)(yi)(yi)種(zhong)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)抗體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)消減都(dou)有發(fa)生(sheng)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)能。流行病(bing)(bing)學資料表明(ming)(ming),DEN幾個(ge)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)感(gan)染(ran)人的(de)(de)(de)(de)(de)(de)概率是不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de),其(qi)中以(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)感(gan)染(ran)概率最高,所以(yi)由(you)其(qi)它(ta)幾種(zhong)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)誘(you)發(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)反應(ying)(ying)很易(yi)識別DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du)(du),由(you)此(ci)DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du)(du)誘(you)發(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)概率明(ming)(ming)顯(xian)(xian)大于DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4;另(ling)外DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du)(du)誘(you)導(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特異免疫(yi)(yi)力(li)又(you)明(ming)(ming)顯(xian)(xian)弱于其(qi)它(ta)3型(xing)(xing),所以(yi)制備(bei)以(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)2為(wei)基礎(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)4價(jia)(jia)疫(yi)(yi)苗和傳統疫(yi)(yi)苗比較,減少了DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4的(de)(de)(de)(de)(de)(de)4種(zhong)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)NS3蛋(dan)白誘(you)發(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)交(jiao)叉免疫(yi)(yi)反應(ying)(ying)之(zhi)(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)干擾作用(yong),減少了DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)能,同(tong)時又(you)能有效而持久(jiu)地誘(you)導(dao)(dao)(dao)機體產生(sheng)針(zhen)對4種(zhong)血(xue)(xue)清型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)反應(ying)(ying),從而起(qi)到預防作用(yong)。
克(ke)隆法 嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)獲得大多是利用感染性(xing)(xing)(xing)克(ke)隆技術,目前已有(you)部(bu)分黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)屬病(bing)(bing)(bing)毒(du)獲得了感染性(xing)(xing)(xing)克(ke)隆,如(ru)YFV、TBEV、Kunjin病(bing)(bing)(bing)毒(du)、墨累河谷腦炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(MVE)、西尼(ni)羅(luo)河病(bing)(bing)(bing)毒(du)(WNV)、DEN4型(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du),這些克(ke)隆包含有(you)病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)全(quan)部(bu)基因(yin),能夠在(zai)(zai)宿主菌中穩定地復制和(he)傳代,以作(zuo)為種子批保存。當構建嵌(qian)(qian)合(he)體(ti)時,在(zai)(zai)供體(ti)基因(yin)和(he)受(shou)(shou)體(ti)基因(yin)的(de)(de)(de)連接(jie)(jie)處,通(tong)過同義突變(bian)或(huo)者保守突變(bian),為受(shou)(shou)體(ti)株和(he)供體(ti)株基因(yin)組添加合(he)適的(de)(de)(de)酶切位點,然后(hou)將兩(liang)者利用酶切位點連接(jie)(jie)起來,制備(bei)嵌(qian)(qian)合(he)性(xing)(xing)(xing)克(ke)隆,體(ti)外經RNA聚(ju)合(he)酶作(zuo)用轉錄出(chu)嵌(qian)(qian)合(he)性(xing)(xing)(xing)轉錄子,轉染細胞后(hou)重新獲得嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)。這項技術的(de)(de)(de)一(yi)個優點在(zai)(zai)于在(zai)(zai)它是在(zai)(zai)cDNA水(shui)平上的(de)(de)(de)操作(zuo),突變(bian)率低、表型(xing)穩定,不像(xiang)傳統疫(yi)苗研制過程中容易發生一(yi)系列的(de)(de)(de)生物(wu)特性(xing)(xing)(xing)改變(bian)。
克隆法
融合PCR 利用PCR技術(shu)制備(bei)嵌(qian)合病(bing)毒最大的(de)優點在(zai)于方便快捷(jie),過去幾個月的(de)工作現在(zai)幾天就能完成。目前生物(wu)(wu)技術(shu)產品(pin)日臻完善,不少公司(si)推出高保真、熱(re)穩定性(xing)好(hao)的(de)逆(ni)轉錄(lu)酶和DNA聚合酶,如(ru)SuperscriptII逆(ni)轉錄(lu)酶、LAro~酶、Exraq酶、ExpandlongtemplatePCR聚合酶系統等,利用這些酶可(ke)(ke)以有效地擴(kuo)增出病(bing)毒基因組(zu)大片段(duan)(>5kh)甚至(zhi)全長的(de)cDNA。用4條引物(wu)(wu)、3次PCR可(ke)(ke)以把兩個異質(zhi)基因片段(duan)連接在(zai)一起。另有報(bao)道(dao)利用3個引物(wu)(wu)、兩次PCR即可(ke)(ke)制備(bei)嵌(qian)合基因,如(ru)YF—MOD嵌(qian)合病(bing)毒。
融合PCR
與克隆技術相比較(jiao),PCR方法更為靈活,可(ke)以選擇任意位(wei)置進行嵌(qian)合(he);但是PCR具(ju)有(you)一(yi)定的(de)突變率,可(ke)能(neng)會帶來一(yi)些致(zhi)死性突變而(er)使轉錄(lu)體不(bu)具(ju)有(you)感染性,得(de)不(bu)到恢復病毒(du)從而(er)前功(gong)盡棄,所以現在大多數實驗還是采取克隆法。
滅活(huo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)之(zhi)間的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)重(zhong)組(zu) 是將(jiang)兩(liang)種或(huo)者(zhe)兩(liang)種以(yi)上的(de)(de)(de)滅活(huo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du),在同一(yi)細胞(bao)內培養(yang)后,它們(men)之(zhi)間發(fa)(fa)生(sheng)基(ji)因(yin)重(zhong)組(zu),有時會產(chan)生(sheng)感(gan)(gan)染性病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du),這種方法(fa)又稱為(wei)多重(zhong)復合(he),可(ke)能(neng)由于滅活(huo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)受損的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)經重(zhong)組(zu)后得以(yi)替補。如(ru)為(wei)了解包膜(mo)(mo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)融(rong)(rong)合(he)活(huo)性,利用(yong)黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)YF一(yi)17DD和(he)流(liu)感(gan)(gan)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)X31兩(liang)者(zhe)不同的(de)(de)(de)融(rong)(rong)合(he)條件,以(yi)及核(he)衣殼不同的(de)(de)(de)形態(tai),將(jiang)YF一(yi)17DD通過(guo)酸處(chu)理失去融(rong)(rong)合(he)活(huo)性,X31通過(guo)熱處(chu)理滅活(huo),兩(liang)者(zhe)在YF一(yi)17DD滅活(huo)的(de)(de)(de)同一(yi)pH值下(xia)發(fa)(fa)生(sheng)融(rong)(rong)和(he)反應,只有發(fa)(fa)生(sheng)融(rong)(rong)和(he)反應的(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)具有感(gan)(gan)染性;流(liu)感(gan)(gan)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)提(ti)供功(gong)能(neng)型(xing)膜(mo)(mo)蛋白融(rong)(rong)合(he)成分,YF一(yi)17DD提(ti)供功(gong)能(neng)基(ji)因(yin)組(zu),結(jie)果兩(liang)個(ge)滅活(huo)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)又重(zhong)新構建成新的(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)。這項技術隨(sui)機性很大(da),但(dan)是可(ke)能(neng)得到(dao)意想不到(dao)的(de)(de)(de)結(jie)果,可(ke)以(yi)用(yong)于病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)功(gong)能(neng)的(de)(de)(de)研究(jiu)。
黃(huang)(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)毒的(de)構(gou)建(jian)前(qian)提(ti)在于,所有(you)(you)的(de)黃(huang)(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒的(de)病(bing)(bing)(bing)毒基(ji)因(yin)(yin)組(zu)的(de)結(jie)構(gou)是高度保守的(de),它們均為單股正鏈RNA病(bing)(bing)(bing)毒,基(ji)因(yin)(yin)組(zu)全長(chang)約l1kb,5端有(you)(you)帽(mao)子結(jie)構(gou),3端無(wu)poly(A)尾,一個長(chang)的(de)開放閱讀框架覆蓋了大部分基(ji)因(yin)(yin)組(zu),共編碼3個結(jie)構(gou)蛋白(bai)和(he)7個非結(jie)構(gou)蛋白(bai),其中以E蛋白(bai)和(he)免疫原性(xing)關系(xi)最(zui)為密切,所以構(gou)建(jian)的(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)毒一般都要(yao)取供體(ti)病(bing)(bing)(bing)毒的(de)E基(ji)因(yin)(yin);但(dan)并不(bu)是所有(you)(you)構(gou)建(jian)的(de)嵌(qian)合性(xing)cDNA克隆都具(ju)有(you)(you)感染性(xing),其主要(yao)影(ying)響因(yin)(yin)素(su)如下。
技術(shu)方面 雖然現(xian)在工具(ju)酶的保(bao)真性(xing)和效率越(yue)來越(yue)好,但(dan)是(shi)黃熱病(bing)毒長(chang)(chang)10kb以(yi)上(shang),在基因(yin)操作(zuo)中不可避免有突(tu)變(bian)(bian)的發(fa)(fa)生(sheng)(sheng)(sheng),而有些(xie)(xie)突(tu)變(bian)(bian)是(shi)致死性(xing)突(tu)變(bian)(bian),使(shi)得構建的全長(chang)(chang)cDNA克(ke)隆或(huo)者(zhe)嵌合體(ti)克(ke)隆沒有感染性(xing)。另外這些(xie)(xie)突(tu)變(bian)(bian)還影(ying)響恢復病(bing)毒的生(sheng)(sheng)(sheng)物學特性(xing),如溫(wen)度敏(min)感性(xing)、噬斑大小、復制能(neng)力、嗜(shi)細胞能(neng)力都可能(neng)發(fa)(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)改變(bian)(bian)。
技術方面
嵌(qian)合(he)(he)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian) 結構(gou)蛋白基因(yin)之(zhi)間(jian)的(de)(de)連(lian)接(jie)處有一段親(qin)(qin)脂(zhi)區序(xu)(xu)(xu)列,是構(gou)建(jian)嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)時(shi)將兩(liang)段異(yi)質核(he)苷酸序(xu)(xu)(xu)列進(jin)行連(lian)接(jie)的(de)(de)嵌(qian)合(he)(he)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)處,這(zhe)(zhe)一段序(xu)(xu)(xu)列的(de)(de)保守性(xing)對于嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)復制能力至關重要。如在(zai)(zai)prM和C基因(yin)之(zhi)間(jian)有信號(hao)肽(tai)酶切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)以及蛋白酶切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian),Cau—four等在(zai)(zai)構(gou)建(jian)YF17D—DEN2嵌(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)時(shi)選擇這(zhe)(zhe)兩(liang)處作為(wei)嵌(qian)合(he)(he)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian),結果在(zai)(zai)信號(hao)肽(tai)酶切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)處嵌(qian)合(he)(he)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)有感(gan)染性(xing),而在(zai)(zai)蛋白酶切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)處進(jin)行連(lian)接(jie)無(wu)法獲得(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du),因(yin)為(wei)在(zai)(zai)兩(liang)個(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)之(zhi)間(jian)有一段親(qin)(qin)脂(zhi)性(xing)的(de)(de)轉(zhuan)膜(mo)區,YFv這(zhe)(zhe)一區域(yu)(yu)比DEN一2該區域(yu)(yu)要多(duo)6個(ge)氨基酸;在(zai)(zai)蛋白酶切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)處構(gou)建(jian)的(de)(de)嵌(qian)合(he)(he)體,由于這(zhe)(zhe)一轉(zhuan)膜(mo)區缺(que)少了6個(ge)氨基酸,蛋白酶和信號(hao)肽(tai)酶不能正確識別(bie)切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian),從而影響(xiang)prM蛋白和E蛋白的(de)(de)成熟,病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)復制過(guo)程受到阻礙(ai),病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)顆粒沒法進(jin)行正常(chang)的(de)(de)包裝(zhuang),所以無(wu)法分(fen)泌出病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)顆粒。
嵌合位點
供體病(bing)毒(du)(du)(du)基(ji)因(yin)(yin) 目(mu)前構(gou)建的(de)(de)嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)多為供體株提(ti)供P和E基(ji)因(yin)(yin),人們也(ye)嘗試(shi)過替代C基(ji)因(yin)(yin)或者(zhe)部(bu)分(fen)基(ji)因(yin)(yin),但多數沒有成(cheng)功(gong),其可(ke)能的(de)(de)原因(yin)(yin)是位于C蛋白(bai)(bai)區域的(de)(de)保守序(xu)列與受體株病(bing)毒(du)(du)(du)順(shun)式結(jie)構(gou)不(bu)相容性,進而對嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)RNA的(de)(de)復制(zhi)產生了毒(du)(du)(du)性,如Kuniin病(bing)毒(du)(du)(du)RNA復制(zhi)必須有同源C蛋白(bai)(bai)上(shang)的(de)(de)第2位和第20位氨(an)基(ji)酸的(de)(de)存,而異(yi)質基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)C蛋白(bai)(bai)不(bu)能協助Kunjin病(bing)毒(du)(du)(du)復制(zhi),所(suo)以(yi)無法長成(cheng)病(bing)毒(du)(du)(du)顆粒(li);另外也(ye)可(ke)能是異(yi)質病(bing)毒(du)(du)(du)之間的(de)(de)蛋白(bai)(bai)酶識(shi)別對方序(xu)列的(de)(de)能力(li)(li)低(di)下(xia),對于C—prM部(bu)位的(de)(de)切(qie)割效率低(di),影(ying)響病(bing)毒(du)(du)(du)正常的(de)(de)裝配(pei)和釋放能力(li)(li)。
供體病毒
受(shou)(shou)體(ti)(ti)病(bing)毒(du)基(ji)因(yin) 作(zuo)為(wei)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)載體(ti)(ti),嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)中(zhong)(zhong)的(de)(de)大部(bu)分基(ji)因(yin)由受(shou)(shou)體(ti)(ti)株提供,嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)的(de)(de)復(fu)制特性(xing)(xing)(xing)(xing)也(ye)主(zhu)要(yao)由受(shou)(shou)體(ti)(ti)株的(de)(de)基(ji)因(yin)控制,其中(zhong)(zhong)有(you)些序列對于嵌(qian)(qian)(qian)合(he)體(ti)(ti)的(de)(de)感(gan)染(ran)性(xing)(xing)(xing)(xing)有(you)決定性(xing)(xing)(xing)(xing)作(zuo)用,在(zai)構(gou)建(jian)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)體(ti)(ti)時,如果這(zhe)部(bu)分序列受(shou)(shou)到破壞,就(jiu)不能夠獲得(de)恢(hui)復(fu)病(bing)毒(du)。如在(zai)構(gou)建(jian)DEN一(yi)4和(he)WNV的(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)時四,由WNVNY99的(de)(de)prM和(he)E基(ji)因(yin)代替DEN一(yi)4相應位(wei)置的(de)(de)基(ji)因(yin),在(zai)構(gou)建(jian)的(de)(de)18個(ge)克隆(long)中(zhong)(zhong)僅有(you)兩(liang)個(ge)具有(you)感(gan)染(ran)性(xing)(xing)(xing)(xing),序列比較發現這(zhe)兩(liang)個(ge)克隆(long)在(zai)prM和(he)C蛋(dan)白之(zhi)間的(de)(de)NS2A—NS2B蛋(dan)白酶切割(ge)位(wei)點(dian)下(xia)游,在(zai)轉膜信號區(qu)域(yu)中(zhong)(zhong)都(dou)包含一(yi)基(ji)序,這(zhe)一(yi)基(ji)序是(shi)酶切割(ge)位(wei)點(dian)下(xia)游的(de)(de)第(di)3位(wei)及第(di)6位(wei)分別為(wei)天冬氨(an)酸和(he)蘇氨(an)酸,另外16個(ge)克隆(long)則沒有(you)該位(wei)點(dian),實(shi)驗表明(ming)這(zhe)兩(liang)個(ge)位(wei)點(dian)似乎和(he)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)性(xing)(xing)(xing)(xing)克隆(long)的(de)(de)感(gan)染(ran)性(xing)(xing)(xing)(xing)有(you)關(guan)。
受體病毒
嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)的一(yi)個最大特點是表型多發生變化(hua),如復制能力(li)、毒(du)(du)力(li)、抗原(yuan)性等(deng),可能的原(yuan)因(yin)是由于缺乏校正(zheng)功能的聚合(he)酶(mei)存在,而有(you)異(yi)質基因(yin)的正(zheng)鏈(lian)RNA病(bing)毒(du)(du),在病(bing)毒(du)(du)復制中具有(you)較(jiao)高的基因(yin)突變率,并且這些(xie)突變為了適應不(bu)(bu)同的宿主細胞,可能會發生一(yi)些(xie)特性改變,從而出現一(yi)些(xie)預想不(bu)(bu)到的結果。
生(sheng)長(chang)(chang)特(te)性(xing)改變 嵌合(he)病(bing)毒的(de)(de)兩個母體病(bing)毒的(de)(de)易感細胞不(bu)同(tong),得到的(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒在不(bu)同(tong)細胞中復制時,由于(yu)缺(que)乏(fa)有(you)效的(de)(de)復制酶(mei)而引(yin)起生(sheng)長(chang)(chang)特(te)性(xing)的(de)(de)改變,其(qi)嗜(shi)細胞性(xing)也會有(you)所改變,另外噬斑(ban)試驗中噬斑(ban)形態
生長特性改變
大小都多(duo)有變(bian)化。如(ru)Chimeri—JE嵌(qian)合(he)體(ti)(ti)在(zai)(zai)(zai)(zai)Vero、LLC—MK,、C6/36細(xi)胞中(zhong)(zhong)復(fu)制(zhi)形(xing)式(shi)類似,而在(zai)(zai)(zai)(zai)MRC一5、FRhl細(xi)胞中(zhong)(zhong)雖然(ran)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)滴(di)(di)度能(neng)夠達到6log。0pfu/mL,但(dan)是(shi)卻不(bu)能(neng)產生CPE,這些特性和(he)母體(ti)(ti)株(zhu)YFV以及JEV都截(jie)然(ran)不(bu)同。LGT1和(he)E5是(shi)TBEV的(de)兩個弱毒(du)株(zhu),與(yu)DEN一4病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)組成的(de)嵌(qian)合(he)體(ti)(ti)在(zai)(zai)(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞中(zhong)(zhong)復(fu)制(zhi)能(neng)力下(xia)降,而轉染蚊蟲(chong)細(xi)胞復(fu)制(zhi)能(neng)力不(bu)受(shou)影響,用在(zai)(zai)(zai)(zai)蚊蟲(chong)細(xi)胞傳代的(de)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)在(zai)(zai)(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞LLC—MK2中(zhong)(zhong)不(bu)能(neng)夠形(xing)成噬斑,而在(zai)(zai)(zai)(zai)早期構(gou)建(jian)的(de)DEN一4和(he)另一個TBEV病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)構(gou)建(jian)的(de)嵌(qian)合(he)體(ti)(ti)在(zai)(zai)(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞中(zhong)(zhong)卻能(neng)夠得到比DEN一4病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)滴(di)(di)度高1000倍的(de)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)。
神(shen)經(jing)內毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)和(he)神(shen)經(jing)外毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing) 神(shen)經(jing)內(外)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)低(di)而(er)免疫原(yuan)性(xing)(xing)(xing)好是一(yi)個理想疫苗應具備的(de)(de)(de)(de)品質(zhi),許(xu)多(duo)實(shi)驗室經(jing)過多(duo)年研(yan)究雖然篩檢出(chu)一(yi)些減毒(du)(du)(du)株(zhu),但是兩者多(duo)不能達到(dao)(dao)有(you)效的(de)(de)(de)(de)統一(yi)。嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)技術以“取長補短”的(de)(de)(de)(de)原(yuan)則(ze),將兩種病(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)免疫原(yuan)性(xing)(xing)(xing)和(he)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)結(jie)合(he)起來,以期研(yan)制理想疫苗,就目(mu)前(qian)得到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)一(yi)些嵌合(he)株(zhu)來說,確實(shi)取得了(le)一(yi)些令(ling)人滿意的(de)(de)(de)(de)結(jie)果,如DEN一(yi)4和(he)WNV的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)與WNV相比高(gao)度減毒(du)(du)(du)四,腦內接(jie)種戒奶小(xiao)鼠,神(shen)經(jing)內毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)降(jiang)(jiang)低(di)至1/28500;腹腔內接(jie)種小(xiao)鼠,神(shen)經(jing)外毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)下降(jiang)(jiang)至1/10000,免疫原(yuan)性(xing)(xing)(xing)好,能安(an)全保護(hu)小(xiao)鼠接(jie)受(shou)野生株(zhu)攻(gong)擊。另外如ChimeriVax—JE嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)也較母體(ti)株(zhu)YFV和(he)JEV呈大幅度下降(jiang)(jiang),而(er)單劑(ji)量又具備很好的(de)(de)(de)(de)免疫保護(hu)力;還有(you)DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)的(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)都(dou)有(you)所下降(jiang)(jiang),這些嵌合(he)體(ti)都(dou)在進(jin)一(yi)步(bu)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究中。
神(shen)經(jing)內毒性和神(shen)經(jing)外毒性
基因(yin)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)性 因(yin)為(wei)RNA病(bing)毒(du)(du)易(yi)以(yi)準種的(de)形式出現和易(yi)變異(yi)的(de)特性,作(zuo)為(wei)活疫苗來使用,一(yi)(yi)(yi)個重要的(de)條件是基因(yin)型要穩(wen)定(ding)(ding)(ding),這(zhe)一(yi)(yi)(yi)點是疫苗安全性的(de)重要表(biao)現。嵌合病(bing)毒(du)(du)的(de)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)性主要通過返祖實驗檢定(ding)(ding)(ding),即(ji)在(zai)(zai)乳鼠腦(nao)內(nei)(nei)(nei)和細胞(bao)(bao)中進行(xing)培養(yang),觀察有(you)無明顯表(biao)型變化(hua),必要時(shi)進行(xing)核(he)苷(gan)酸鑒定(ding)(ding)(ding),如ChimeriVax-JE嵌合病(bing)毒(du)(du)115.161在(zai)(zai)細胞(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)傳代(dai)l8次(ci)以(yi)及在(zai)(zai)乳鼠腦(nao)內(nei)(nei)(nei)傳代(dai)6次(ci)并沒(mei)有(you)毒(du)(du)力的(de)回升,對減(jian)毒(du)(du)位點進行(xing)測序也沒(mei)有(you)發(fa)生(sheng)(sheng)核(he)苷(gan)酸改變。而有(you)的(de)嵌合病(bing)毒(du)(du)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)性不夠好如DEN一(yi)(yi)(yi)2/DEN一(yi)(yi)(yi)4、DEN一(yi)(yi)(yi)2/DEN—l復制(zhi)能力較(jiao)弱,而經過幾次(ci)傳代(dai)后得到較(jiao)高的(de)病(bing)毒(du)(du)滴(di)度,是因(yin)為(wei)發(fa)生(sheng)(sheng)了一(yi)(yi)(yi)些突(tu)變。在(zai)(zai)體(ti)外轉(zhuan)錄時(shi)產生(sheng)(sheng)了轉(zhuan)錄體(ti)的(de)雜和體(ti),在(zai)(zai)轉(zhuan)染后經過細胞(bao)(bao)復制(zhi),復制(zhi)能力增(zeng)強的(de)病(bing)毒(du)(du)逐漸(jian)占主要優勢(shi),在(zai)(zai)LLC—MK2細胞(bao)(bao)中病(bing)毒(du)(du)傳代(dai)可(ke)以(yi)保持較(jiao)高的(de)遺(yi)傳穩(wen)定(ding)(ding)(ding)性,所(suo)以(yi)在(zai)(zai)制(zhi)備嵌合疫苗時(shi),應盡(jin)量減(jian)少病(bing)毒(du)(du)在(zai)(zai)哺乳動物細胞(bao)(bao)中傳代(dai)的(de)次(ci)數。
基因穩定性
在黃熱病(bing)(bing)毒嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)毒發展的(de)這十幾年中,人們(men)嘗試構建了多(duo)種嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)毒,其(qi)中大部分(fen)是(shi)以制備疫(yi)苗為目的(de),另(ling)外還(huan)用于(yu)病(bing)(bing)毒的(de)分(fen)子生物(wu)學特(te)性(xing)研究(jiu)。
分(fen)子生物學(xue)特性(xing)研究 型內嵌合病毒(du)(du)(du)(du)可以(yi)用(yong)于(yu)了解病毒(du)(du)(du)(du)復(fu)(fu)制(zhi)能(neng)(neng)力(li)(li),進一步(bu)了解各基(ji)因(yin)的(de)功能(neng)(neng)。如構建(jian)同型不(bu)同株(zhu)(zhu)之(zhi)間(jian)DEN一216681/PDK一53、DEN25ol/04株(zhu)(zhu)之(zhi)間(jian)的(de)型內嵌合疫(yi)苗,研究DEN一2型病毒(du)(du)(du)(du)結構蛋白區(qu)對(dui)乳鼠(shu)神經毒(du)(du)(du)(du)性(xing)的(de)影(ying)響(xiang)。可以(yi)用(yong)于(yu)推測病毒(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)力(li)(li)位(wei)點(dian)(dian),由2個JEV病毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)cDNA克隆(long)提(ti)供5端,3個病毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)cDNA提(ti)供的(de)3端進行組(zu)合,感染(ran)細(xi)胞后重新(xin)獲得6種重組(zu)JEV病毒(du)(du)(du)(du)。根據噬菌斑大小篩(shai)選(xuan)到3個減毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu),比較6種重組(zu)病毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)和(he)野生株(zhu)(zhu)的(de)基(ji)因(yin)序列,發(fa)現僅(jin)(jin)僅(jin)(jin)是(shi)(shi)E138(Glu—Lys)一個氨基(ji)酸位(wei)點(dian)(dian)不(bu)同,說(shuo)明(ming)這個位(wei)點(dian)(dian)和(he)毒(du)(du)(du)(du)力(li)(li)之(zhi)間(jian)關系(xi)密(mi)切(qie);另外發(fa)現該突變(bian)株(zhu)(zhu)雖(sui)然毒(du)(du)(du)(du)性(xing)降低(di),但是(shi)(shi)腦內注射接種小鼠(shu)后仍能(neng)(neng)在(zai)腦內復(fu)(fu)制(zhi),但是(shi)(shi)病毒(du)(du)(du)(du)滴度比較低(di),看來其減毒(du)(du)(du)(du)機制(zhi)不(bu)在(zai)于(yu)病毒(du)(du)(du)(du)的(de)復(fu)(fu)制(zhi),而可能(neng)(neng)是(shi)(shi)影(ying)響(xiang)復(fu)(fu)制(zhi)的(de)早期機制(zhi),在(zai)細(xi)胞之(zhi)間(jian)傳遞速度比較慢,從而使免疫(yi)系(xi)統(tong)能(neng)(neng)及時清(qing)除(chu)病毒(du)(du)(du)(du)。
分子生物(wu)學特性研究
型(xing)間嵌合(he)病毒(du)也(ye)可以(yi)用于分子(zi)生(sheng)(sheng)物學特(te)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)研究,如(ru)黃熱(re)病毒(du)和(he)(he)(he)日本腦炎病毒(du)雖然(ran)同屬黃熱(re)病毒(du)屬,但(dan)是有(you)很多生(sheng)(sheng)物學特(te)性(xing)(xing)(xing)都(dou)(dou)不盡相(xiang)(xiang)同,如(ru)抗原(yuan)性(xing)(xing)(xing)相(xiang)(xiang)差很遠、中間宿主不同、引(yin)起人(ren)體(ti)發(fa)(fa)(fa)病的(de)(de)癥狀也(ye)截然(ran)不同;兩(liang)者雖然(ran)從同一病毒(du)得來,但(dan)是在進化的(de)(de)過程中發(fa)(fa)(fa)生(sheng)(sheng)了(le)很大(da)的(de)(de)變化,構(gou)(gou)建的(de)(de)嵌合(he)病毒(du)YF/JE(S)其生(sheng)(sheng)物學特(te)性(xing)(xing)(xing)也(ye)有(you)所改變,如(ru)神(shen)經內毒(du)性(xing)(xing)(xing)和(he)(he)(he)神(shen)經外毒(du)性(xing)(xing)(xing)都(dou)(dou)有(you)所降(jiang)低,和(he)(he)(he)其供體(ti)株SAl4一l4—2相(xiang)(xiang)似;而構(gou)(gou)建的(de)(de)另一個嵌合(he)株YF/JE(N)神(shen)經毒(du)性(xing)(xing)(xing)卻很高(gao),和(he)(he)(he)供體(ti)株Nakayama特(te)性(xing)(xing)(xing)一致(zhi);這(zhe)(zhe)說明確(que)實如(ru)原(yuan)先(xian)預(yu)料,和(he)(he)(he)減毒(du)有(you)關的(de)(de)表位主要存在E蛋白中,而同時(shi)也(ye)發(fa)(fa)(fa)現,和(he)(he)(he)原(yuan)來的(de)(de)SA14-14-2相(xiang)(xiang)比較,嵌合(he)株在細胞(bao)中復制能力(li)升高(gao),病毒(du)滴度較高(gao),免(mian)疫(yi)原(yuan)性(xing)(xing)(xing)增(zeng)加,這(zhe)(zhe)又說明是YF一17DD病毒(du)的(de)(de)非結構(gou)(gou)蛋白發(fa)(fa)(fa)揮作(zuo)用。
候選疫苗 ChimeriVax-JE嵌合(he)病毒
候選疫苗
日(ri)本腦(nao)炎是(shi)一(yi)(yi)(yi)種影響(xiang)中(zhong)(zhong)樞神經(jing)系(xi)統的(de)(de)(de)(de)疾病(bing)(bing)(bing),主要流行于亞洲(zhou),但(dan)是(shi)近(jin)年(nian)在(zai)澳(ao)洲(zhou)、美(mei)洲(zhou)也有(you)(you)病(bing)(bing)(bing)例(li)發生(sheng),每年(nian)官方報道全(quan)球有(you)(you)5萬(wan)病(bing)(bing)(bing)例(li),其中(zhong)(zhong)有(you)(you)l萬(wan)例(li)是(shi)致(zhi)死性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de);雖然目前有(you)(you)活疫苗(miao)(miao)、滅活疫苗(miao)(miao)的(de)(de)(de)(de)使(shi)用,但(dan)是(shi)這些疫苗(miao)(miao)具有(you)(you)免(mian)疫原性(xing)(xing)不夠(gou)、價格(ge)偏(pian)高、制作工藝不被WHO認(ren)可等劣勢,所以(yi)還有(you)(you)必要開發研制新(xin)疫苗(miao)(miao)。1999年(nian)Chambers等以(yi)SA14-14-2的(de)(de)(de)(de)prM和(he)E基因代替YF一(yi)(yi)(yi)17DD疫苗(miao)(miao)株(zhu)的(de)(de)(de)(de)相應基因構建(jian)了嵌合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)ChimeriVax—JE15,16,,該病(bing)(bing)(bing)毒(du)能在(zai)WHO認(ren)可的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)很好地被培養,恢復病(bing)(bing)(bing)毒(du)和(he)YF一(yi)(yi)(yi)17DD、SA14—14-2相比較,以(yi)6log0pfu的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)腦(nao)內(nei)接(jie)(jie)種3-4周齡(ling)小鼠無一(yi)(yi)(yi)例(li)發病(bing)(bing)(bing),而(er)接(jie)(jie)種YF-17DD的(de)(de)(de)(de)小鼠全(quan)部(bu)死亡(wang);另外用3.2log0pfu劑量的(de)(de)(de)(de)SA14-14-2接(jie)(jie)種,能在(zai)85%一(yi)(yi)(yi)95%的(de)(de)(de)(de)接(jie)(jie)種者中(zhong)(zhong)產生(sheng)中(zhong)(zhong)和(he)抗(kang)體,抗(kang)體平均(jun)滴度(du)能夠(gou)達到(dao)PRNT~o<30,血(xue)清(qing)陽轉率(lv)小于80%;而(er)接(jie)(jie)種4~51og0pfu的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)(he)疫苗(miao)(miao)后,能夠(gou)達到(dao)100%的(de)(de)(de)(de)血(xue)清(qing)陽轉率(lv),接(jie)(jie)種后30dPRNT能夠(gou)達到(dao)129~327,這些結果(guo)表明構建(jian)的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)神經(jing)內(nei)毒(du)性(xing)(xing)呈大幅度(du)降(jiang)低;用乳鼠以(yi)及猴子進(jin)行安全(quan)試(shi)(shi)驗檢測(ce),進(jin)一(yi)(yi)(yi)步證(zheng)實了該病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)弱(ruo)神經(jing)毒(du)性(xing)(xing),內(nei)臟(zang)毒(du)性(xing)(xing)也下降(jiang)。目前該疫苗(miao)(miao)已(yi)經(jing)通過一(yi)(yi)(yi)期臨床試(shi)(shi)驗,是(shi)很有(you)(you)前途(tu)的(de)(de)(de)(de)疫苗(miao)(miao)候選株(zhu)。
登革病(bing)毒多價疫(yi)苗
登(deng)(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)是目(mu)前(qian)誘發(fa)疾病(bing)最多的(de)(de)(de)(de)(de)黃熱(re)病(bing)毒(du)(du),在(zai)人口聚集的(de)(de)(de)(de)(de)熱(re)帶及亞(ya)熱(re)帶時有(you)(you)(you)爆發(fa),因為登(deng)(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)4個(ge)血清型(xing)之(zhi)間可以產生交叉保護力(li)(li)(li),所以感染(ran)一(yi)(yi)種病(bing)毒(du)(du)后,能(neng)(neng)夠(gou)對另(ling)外(wai)3種血清型(xing)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)抗體反(fan)應。在(zai)機體遭受另(ling)一(yi)(yi)種血清型(xing)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)感染(ran)后,由于抗體依賴的(de)(de)(de)(de)(de)復制能(neng)(neng)力(li)(li)(li)增強作(zuo)用可能(neng)(neng)誘發(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)生,因此(ci)理想的(de)(de)(de)(de)(de)疫(yi)苗應該能(neng)(neng)夠(gou)產生針(zhen)對4個(ge)型(xing)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)中和(he)抗體和(he)T細胞免疫(yi)。目(mu)前(qian)主(zhu)要有(you)(you)(you)兩個(ge)實驗室(shi)分別以DEN一(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)53和(he)YF一(yi)(yi)17DD作(zuo)為受體株構建了包括DEN一(yi)(yi)1到DEN-4型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合株,結果(guo)有(you)(you)(you)很好的(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)原性(xing)、較高的(de)(de)(de)(de)(de)復制效率和(he)穩定性(xing),在(zai)動物實驗中證明毒(du)(du)性(xing)減低,小(xiao)鼠效力(li)(li)(li)實驗安全有(you)(you)(you)效,有(you)(you)(you)望(wang)成(cheng)為登(deng)(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)疫(yi)苗的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)展方向。
另外還有YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)報道,都(dou)出(chu)(chu)現一(yi)(yi)些令人滿意(yi)的(de)特性,進一(yi)(yi)步研究正在進行中。嵌合(he)病毒(du)的(de)出(chu)(chu)現是獲得減毒(du)活(huo)疫(yi)苗的(de)一(yi)(yi)個(ge)(ge)新(xin)途(tu)徑,和傳統(tong)方法相(xiang)比具有目標明確、免疫(yi)效果(guo)好、減毒(du)穩定的(de)優(you)勢,但(dan)該(gai)技(ji)術目前還處于探索階(jie)段,有時結果(guo)很出(chu)(chu)人意(yi)料,所以在構建一(yi)(yi)個(ge)(ge)新(xin)的(de)嵌合(he)體(ti)時,要(yao)時刻注意(yi)安全性問題,否則會適得其反,創造出(chu)(chu)新(xin)的(de)毒(du)性更強的(de)病毒(du),為人類(lei)帶來危害。
嵌合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)是應用(yong)(yong)基(ji)(ji)因(yin)工程手段構建(jian)基(ji)(ji)因(yin)能(neng)表達兩種以上病原體(ti)抗原的(de)一類新型(xing)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao),應用(yong)(yong)嵌合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)可(ke)解(jie)決多(duo)次接種問題。本文綜(zong)述了(le)目前世界一些國家研(yan)制的(de)嵌合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao),如登革病毒(du)、乙型(xing)腦炎病毒(du)、呼(hu)吸道合(he)胞病毒(du)、副流感病毒(du)、人(ren)類免疫(yi)(yi)(yi)缺陷病病毒(du)及人(ren)乳頭(tou)瘤(liu)病毒(du)等相關嵌合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)研(yan)究策略和(he)方法、免疫(yi)(yi)(yi)學評價(jia)及其應用(yong)(yong)前景。