【基因(yin)測序是什(shen)么(me)】基因(yin)測序有什(shen)么(me)用 基因(yin)測序原理技術(shu)
隨著基(ji)因測(ce)序(xu)技(ji)術的(de)發展和費用的(de)降低(di)，現在(zai)普通人也可(ke)以在(zai)可(ke)承受的(de)經濟范圍內進行個體(ti)測(ce)序(xu)分析(xi)，測(ce)序(xu)技(ji)術成(cheng)為精(jing)準醫學發展和個體(ti)化治療中(zhong)一個非常重要的(de)工(gong)具，我們即將迎來一個全民測(ce)序(xu)的(de)時代(dai)。而這(zhe)樣(yang)一種強大的(de)工(gong)具在(zai)科學家們的(de)手中(zhong)又(you)可(ke)以發揮出(chu)更(geng)大價(jia)值，挖掘出(chu)更(geng)有深度的(de)信息。基(ji)因測(ce)序(xu)技(ji)術在(zai)精(jing)準醫學中(zhong)得到(dao)了哪些應用呢(ni)？小編(bian)從(cong)以下幾(ji)個方面結合已發表文章進行了總結。
基因測序助力癌癥研究尋找治療靶點
在2016年(nian)4月8日那期(qi)(qi)Science期(qi)(qi)刊上，美國(guo)布羅德(de)研(yan)究所Aviv Regev的(de)(de)(de)(de)領導的(de)(de)(de)(de)癌癥(zheng)研(yan)究團隊通過(guo)與(yu)麻省理工學院副教授(shou)、單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)析(xi)先(xian)鋒Alex Shalek合作(zuo)，利用單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)RNA-seq方法每(mei)(mei)次(ci)(ci)一個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)地研(yan)究整(zheng)個腫(zhong)瘤(liu)以便(bian)確定(ding)(ding)哪些(xie)類型的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)存在于(yu)腫(zhong)瘤(liu)中(zhong)(zhong)。他(ta)們(men)不僅分(fen)析(xi)了惡性腫(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，而且也(ye)分(fen)析(xi)了腫(zhong)瘤(liu)內所有不同類型的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。這(zhe)是首次(ci)(ci)開展這(zhe)樣(yang)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究。如今(jin)，他(ta)們(men)知道每(mei)(mei)種腫(zhong)瘤(liu)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)組成，也(ye)知道每(mei)(mei)種類型的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)表達模(mo)式，這(zhe)樣(yang)就(jiu)能夠回個頭去重(zhong)新分(fen)析(xi)一些(xie)大體積(ji)腫(zhong)瘤(liu)測(ce)序(xu)數(shu)據（比如，癌癥(zheng)基(ji)因(yin)組圖譜）以便(bian)從(cong)現存的(de)(de)(de)(de)數(shu)據中(zhong)(zhong)找出細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)如何相互作(zuo)用和一定(ding)(ding)程度(du)上利用細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)重(zhong)建(jian)大塊(kuai)腫(zhong)瘤(liu)樣(yang)品的(de)(de)(de)(de)整(zheng)體行為。
在(zai)一篇發表在(zai)國(guo)際學術期刊Nature Communication上的(de)文章(zhang)中(zhong)，來(lai)自美(mei)國(guo)的(de)科學家們對109名(ming)胰腺(xian)導管腺(xian)癌（PDA）病人進行(xing)了全外顯子(zi)測序，發現(xian)了PDA中(zhong)的(de)基因(yin)突(tu)變多樣性，并且為發現(xian)PDA治療靶點提供了重(zhong)要信(xin)息。
在該項研究中，研究人員(yuan)為方便檢測(ce)(ce)基因(yin)突(tu)變，同(tong)時移除非腫瘤性組(zu)織的(de)污(wu)染，他(ta)們利用顯微切割的(de)方法(fa)將(jiang)癌癥患者(zhe)的(de)腫瘤組(zu)織進行了(le)異種移植(zhi)并(bing)建立了(le)細胞系。隨(sui)后對(dui)109例進行過(guo)顯微切割的(de)PDA病(bing)例進行了(le)全外顯子測(ce)(ce)序，經過(guo)顯微切割操作后，腫瘤細胞得到富集并(bing)增(zeng)強了(le)對(dui)基因(yin)突(tu)變的(de)檢測(ce)(ce)。研究人員(yuan)通(tong)過(guo)分析(xi)發現導致PDA發生的(de)病(bing)因(yin)事件與腫瘤突(tu)變譜(pu)具(ju)有明顯相(xiang)關性。
基因測序幫助尋找生物標記物 助力疾病診斷
在(zai)歐洲泌尿外科協會的(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)者(zhe)公布的(de)(de)一項(xiang)最新研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)成果中，研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)者(zhe)對64份前列腺組(zu)織樣(yang)本(ben)進(jin)行(xing)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)，對每一種樣(yang)本(ben)中的(de)(de)2億個序(xu)列進(jin)行(xing)閱(yue)讀分析(xi)，結果研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)者(zhe)發現(xian)(xian)在(zai)腫瘤和(he)控(kong)制樣(yang)本(ben)中有(you)(you)超過2000個基因都(dou)表現(xian)(xian)出了明(ming)顯(xian)的(de)(de)差異(yi)性，其中有(you)(you)些相(xiang)比已知(zhi)的(de)(de)前列腺癌標志物而(er)言表現(xian)(xian)出了較高的(de)(de)特異(yi)性和(he)敏感性;其中一種名(ming)為(wei)TAPIR的(de)(de)非編(bian)碼(ma)RNAs則可以有(you)(you)效抑(yi)制癌細(xi)胞(bao)的(de)(de)生(sheng)長，盡管其可以轉化(hua)為(wei)臨床有(you)(you)用(yong)的(de)(de)治療靶點還(huan)為(wei)時尚(shang)早。
研究(jiu)者在(zai)前列(lie)(lie)腺(xian)癌患者的(de)尿液中(zhong)發現(xian)了這些(xie)生物(wu)標(biao)(biao)志物(wu)，檢測(ce)結果(guo)顯示其(qi)可以幫助進行(xing)準(zhun)確的(de)前列(lie)(lie)腺(xian)癌檢測(ce)，基(ji)于相關(guan)研究(jiu)結果(guo)，研究(jiu)人(ren)員決定開發一種(zhong)進行(xing)前列(lie)(lie)腺(xian)癌早期診斷的(de)高特(te)異性(xing)及敏感(gan)性(xing)的(de)，且基(ji)于尿液的(de)檢測(ce)手段;這種(zhong)檢測(ce)方(fang)法基(ji)于對多個生物(wu)標(biao)(biao)志物(wu)的(de)組合，相比單一標(biao)(biao)志物(wu)而言將(jiang)表現(xian)出較高的(de)特(te)異性(xing)。
基因測序幫助監測全球性疾病暴發
在一(yi)篇發表于(yu)Nature雜志上的(de)報道中(zhong)，來自(zi)伯明(ming)翰大學的(de)研(yan)究(jiu)人員解釋了如何利用(yong)基因組測序(xu)的(de)技(ji)術來快速(su)實現對疾(ji)病(bing)暴(bao)發的(de)有效監測;文章中(zhong)他們(men)開發了一(yi)種(zhong)(zhong)手提箱(xiang)式的(de)基因組測序(xu)“實驗(yan)室”，其(qi)中(zhong)包含有一(yi)種(zhong)(zhong)新(xin)型的(de)DNA測序(xu)儀，最初該設備用(yong)于(yu)2015年4月在幾(ji)內亞對埃博拉病(bing)人的(de)樣本(ben)進行檢測。
這(zhe)項研(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)，研(yan)究(jiu)(jiu)人員利用這(zhe)種便(bian)攜(xie)式的(de)(de)(de)DNA測序儀在(zai)整個(ge)基因組庫中(zhong)鑒別出了新型的(de)(de)(de)單核苷酸多態性(xing)（SNPs），目前當測序工(gong)作(zuo)局(ju)限于(yu)實(shi)驗室(shi)的(de)(de)(de)時候，這(zhe)種便(bian)攜(xie)式機(ji)器的(de)(de)(de)開發(fa)對于(yu)有效進行(xing)疾(ji)病(bing)暴(bao)發(fa)的(de)(de)(de)監測而言非常重要，研(yan)究(jiu)(jiu)者們還希望可(ke)以將這(zhe)種便(bian)攜(xie)式的(de)(de)(de)機(ji)器應用于(yu)別的(de)(de)(de)領(ling)域的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)，比如癌(ai)癥研(yan)究(jiu)(jiu)等。
在另外一項研究(jiu)中，來自英國牛津大學和巴(ba)西(xi)Evandro Chagas研究(jiu)所等機構(gou)的研究(jiu)人員(yuan)對巴(ba)西(xi)的寨卡病毒暴發進行首個基(ji)因組分析，從而提供(gong)關于這(zhe)種(zhong)病毒如何和何時可(ke)能(neng)進入(ru)美洲方(fang)面的新信息。
研究人員對7株巴西寨卡病毒毒株的基因組進行測序，包括一株毒株來自一例致命的成年人病例和另一株毒株來自一名頭小畸型新生兒。
1、第一代測序
1.1 Sanger 測序
采用的(de)(de)(de)是(shi)直接測(ce)(ce)序法。1977年，Frederick Sanger 等發明了雙脫氧鏈(lian)末端終止法，這一技術(shu)隨后成為最為常(chang)用的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)測(ce)(ce)序技術(shu)。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 發 明了 Sanger 測(ce)(ce)序法，并在此后的(de)(de)(de) 10 年里成為基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)檢測(ce)(ce)的(de)(de)(de)金標準。其基(ji)(ji)(ji)本(ben)原理即雙脫氧核(he)苷三磷酸(suan)（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）缺乏PCR 延(yan)伸所需的(de)(de)(de) 3'-OH，因(yin)(yin)此每當 DNA 鏈(lian)加(jia)入(ru)分(fen)(fen)子 ddNTP，延(yan)伸便終止。每一次 DNA 測(ce)(ce)序是(shi)由 4個(ge)獨立的(de)(de)(de)反應(ying)組(zu)成，將(jiang)模(mo)板、引物和 4 種含有(you)不(bu)同的(de)(de)(de)放(fang)射性同位(wei)素(su)標記(ji)的(de)(de)(de)核(he)苷酸(suan)的(de)(de)(de) ddNTP 分(fen)(fen)別與DNA 聚(ju)合酶混合形成長短不(bu)一的(de)(de)(de)片段，大量起(qi)始(shi)點相同、終止點不(bu)同的(de)(de)(de) DNA 片段存在于反應(ying)體系中，具有(you)單(dan)個(ge)堿基(ji)(ji)(ji)差別的(de)(de)(de) DNA 序列可以被聚(ju)丙烯(xi)酰胺(an)變(bian)性凝(ning)膠電泳分(fen)(fen)離出來，得到放(fang)射性同位(wei)素(su)自(zi)顯影(ying)條(tiao)帶。依據電泳條(tiao)帶讀取(qu) DNA 雙鏈(lian)的(de)(de)(de)堿基(ji)(ji)(ji)序列。
人類基(ji)因(yin)(yin)組(zu)的(de)(de)(de)(de)測(ce)序(xu)(xu)正是基(ji)于該(gai)技術完(wan)成(cheng)的(de)(de)(de)(de)。Sanger 測(ce)序(xu)(xu)這種直(zhi)接(jie)測(ce)序(xu)(xu)方法(fa)具有高(gao)度的(de)(de)(de)(de)準確性和簡單(dan)、快捷等特(te)點(dian)。目前(qian)，依然對于一些(xie)臨床上(shang)(shang)小(xiao)樣本遺傳(chuan)疾病(bing)基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)鑒定具有很高(gao)的(de)(de)(de)(de)實用價值。例如，臨床上(shang)(shang)采用 Sanger 直(zhi)接(jie)測(ce)序(xu)(xu) FGFR 2 基(ji)因(yin)(yin)證實單(dan)基(ji)因(yin)(yin) Apert 綜合(he)征和直(zhi)接(jie)測(ce)序(xu)(xu) TCOF1 基(ji)因(yin)(yin)可以(yi)檢出多達(da) 90% 的(de)(de)(de)(de)與(yu) Treacher Collins 綜合(he)征相關(guan)的(de)(de)(de)(de)突變。值得注(zhu)意的(de)(de)(de)(de)是，Sanger 測(ce)序(xu)(xu)是針對已知致病(bing)基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)突變位(wei)點(dian)設計(ji)引(yin)物，進行 PCR 直(zhi)接(jie)擴增(zeng)測(ce)序(xu)(xu)。單(dan)個(ge)突變點(dian)的(de)(de)(de)(de)擴增(zeng)包括(kuo)該(gai)位(wei)點(dian)在內的(de)(de)(de)(de)外顯子片段即可，不必將該(gai)點(dian)所在基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)全部外顯子都擴增(zeng)。
因(yin)(yin)(yin)(yin)此，應明確定位(wei)(wei)要擴增的(de)(de)位(wei)(wei)點(dian)(dian)所在(zai)的(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)(yin)外(wai)(wai)顯子和(he)(he)該(gai)點(dian)(dian)的(de)(de)具(ju)體位(wei)(wei)置，設計包(bao)括該(gai)點(dian)(dian)在(zai)內(nei)的(de)(de)上下(xia)游(you) 150 ~ 200 bp 的(de)(de)外(wai)(wai)顯子片(pian)段(duan)引物。此外(wai)(wai)，盡管有NGS 的(de)(de)出現，但 Sanger 測(ce)序對于有致(zhi)病基因(yin)(yin)(yin)(yin)位(wei)(wei)點(dian)(dian)明確并且數量有限的(de)(de)單(dan)基因(yin)(yin)(yin)(yin)遺(yi)傳疾病的(de)(de)致(zhi)病基因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)檢測(ce)是(shi)非(fei)常經濟和(he)(he)高(gao)效的(de)(de)。到目(mu)前為止，Sanger 測(ce)序仍(reng)然是(shi)作(zuo)為基因(yin)(yin)(yin)(yin)檢測(ce)的(de)(de)金標準(zhun)，也是(shi) NGS 基因(yin)(yin)(yin)(yin)檢測(ce)后進行家系內(nei)和(he)(he)正常對照(zhao)組驗證的(de)(de)主要手段(duan)。
值得(de)注意的是，Sanger 測序(xu)目(mu)的是尋(xun)找與疾(ji)病有關的特定(ding)(ding)的基(ji)(ji)因突(tu)變。對于(yu)沒有明(ming)確候選基(ji)(ji)因或(huo)候選基(ji)(ji)因數量較多的大(da)樣(yang)本病例(li)篩(shai)查(cha)是難以完成的，此類(lei)測序(xu)研究還(huan)要依靠具(ju)有高(gao)通量測序(xu)能力的 NGS。雖然 Sanger 測序(xu)具(ju)有高(gao)度的分析準(zhun)確性(xing)(xing)，但其(qi)準(zhun)確性(xing)(xing)還(huan)取(qu)決于(yu)測序(xu)儀器(qi)以及測序(xu)條(tiao)件的設定(ding)(ding)。另外，Sanger 測序(xu)不(bu)能檢測出(chu)大(da)片(pian)段缺失或(huo)拷貝數變異等基(ji)(ji)因突(tu)變的類(lei)型，因此對于(yu)一些與此相關的遺傳性(xing)(xing)疾(ji)病還(huan)不(bu)能做出(chu)基(ji)(ji)因學診斷(duan)。
1.2 連鎖分析
采用的(de)是(shi)間(jian)(jian)接測序(xu)法(fa)。在(zai)(zai)(zai) NGS 出現之前(qian)，國際通(tong)用的(de)疾病基(ji)(ji)(ji)因(yin)定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)克(ke)隆(long)策略是(shi)建(jian)立在(zai)(zai)(zai)大規模全(quan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)掃描和(he)連(lian)鎖分析(xi)(xi)基(ji)(ji)(ji)礎上(shang)(shang)的(de)位(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)候選基(ji)(ji)(ji)因(yin)克(ke)隆(long)。人類的(de)染(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)成對(dui)(dui)出現，一(yi)(yi)(yi)條來自父親，一(yi)(yi)(yi)條來自母(mu)親，每一(yi)(yi)(yi)對(dui)(dui)染(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)在(zai)(zai)(zai)同(tong)樣(yang)的(de)位(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)上(shang)(shang)擁有(you)相同(tong)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)，但是(shi)其序(xu)列(lie)并不(bu)完全(quan)相同(tong)，被稱為父系(xi)(xi)(xi)和(he)母(mu)系(xi)(xi)(xi)等位(wei)(wei)(wei)(wei)基(ji)(ji)(ji)因(yin)。遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)記(ji)(ji)是(shi)指(zhi)在(zai)(zai)(zai)人群中表(biao)(biao)現出多(duo)態現象的(de) DNA 序(xu)列(lie)，可(ke)追蹤(zong)染(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)、染(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)某(mou)一(yi)(yi)(yi)節段或某(mou)個(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)座在(zai)(zai)(zai)家系(xi)(xi)(xi)中傳(chuan)(chuan)(chuan)遞的(de)任何一(yi)(yi)(yi)種遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)特(te)性。它存在(zai)(zai)(zai)于每一(yi)(yi)(yi)個(ge)人，但大小和(he)序(xu)列(lie)有(you)差別，具有(you)可(ke)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)性和(he)可(ke)識(shi)別性。目前(qian)采用第二代遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)記(ji)(ji)，即重復序(xu)列(lie)多(duo)態性，特(te)別是(shi)短(duan)串聯重復序(xu)列(lie)，又稱微(wei)衛(wei)星標(biao)記(ji)(ji)。連(lian)鎖分析(xi)(xi)是(shi)以(yi)(yi)(yi)連(lian)鎖這種遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)現象為基(ji)(ji)(ji)礎，研究致(zhi)病基(ji)(ji)(ji)因(yin)與遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)性標(biao)記(ji)(ji)之間(jian)(jian)關系(xi)(xi)(xi)的(de)方法(fa)。如果控制(zhi)某(mou)一(yi)(yi)(yi)表(biao)(biao)型性狀的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)附(fu)近存在(zai)(zai)(zai)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)記(ji)(ji)，那(nei)么利(li)用某(mou)個(ge)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)記(ji)(ji)與某(mou)個(ge)擬定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)之間(jian)(jian)是(shi)否存在(zai)(zai)(zai)連(lian)鎖關系(xi)(xi)(xi)，以(yi)(yi)(yi)及(ji)連(lian)鎖的(de)緊密程度就能將(jiang)(jiang)該基(ji)(ji)(ji)因(yin)定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)到(dao)染(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)某(mou)一(yi)(yi)(yi)位(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)上(shang)(shang)。1986 年(nian) Morton 等提(ti)出優勢對(dui)(dui)數記(ji)(ji)分法(fa)（og odds score method，LOD），主要檢(jian)測兩基(ji)(ji)(ji)因(yin)以(yi)(yi)(yi)某(mou)一(yi)(yi)(yi)重組率(lv)連(lian)鎖時的(de)似(si)然性。LOD 值為正，支(zhi)持連(lian)鎖；LOD 值為負，則否定(ding)連(lian)鎖。通(tong)過計(ji)算(suan)家系(xi)(xi)(xi)中的(de)微(wei)衛(wei)星標(biao)記(ji)(ji)與致(zhi)病位(wei)(wei)(wei)(wei)點之間(jian)(jian)的(de) LOD 值，可(ke)以(yi)(yi)(yi)初(chu)步估(gu)算(suan)二者(zhe)間(jian)(jian)的(de)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)距離(li)及(ji)連(lian)鎖程度，從而確定(ding)該基(ji)(ji)(ji)因(yin)在(zai)(zai)(zai)染(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)上(shang)(shang)的(de)粗略位(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)。然后(hou)利(li)用該區(qu)域的(de)染(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)基(ji)(ji)(ji)因(yin)圖譜(pu)，分析(xi)(xi)定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)區(qu)域內(nei)所有(you)基(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)功能與表(biao)(biao)達，選擇(ze)合適的(de)候選基(ji)(ji)(ji)因(yin)進(jin)行突變檢(jian)測，最(zui)終將(jiang)(jiang)致(zhi)病基(ji)(ji)(ji)因(yin)定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)或克(ke)隆(long)。
然而，采用連(lian)鎖(suo)分析進行(xing)基因(yin)檢(jian)測存在(zai)很大的局限性(xing)。不(bu)但所需遺傳樣本量較大，一(yi)(yi)般要求提(ti)供(gong)三代及以上(shang)遺傳家系患者(zhe)血樣，而且數據量大、處(chu)理復雜、產出(chu)速度(du)較慢、定位不(bu)夠(gou)精確（一(yi)(yi)般只能(neng)定位在(zai)染色體某(mou)一(yi)(yi)區間），這就使得研(yan)究工作繁重和定位基因(yin)的時間周期特(te)別長(chang)。目前(qian)，連(lian)鎖(suo)分析采用的單核苷(gan)酸(suan)多肽性(xing)和短(duan)串聯重復序列還在(zai)使用，但經典的間接測序方法，如單鏈(lian)構象多肽性(xing)、變性(xing)梯度(du)凝膠電(dian)泳和異源(yuan)雙鏈(lian)分析在(zai)美國已被淘汰，而在(zai)發(fa)展中(zhong)國家作為(wei)研(yan)究手段還在(zai)有限使用。
2、新一代測序（NGS）
主(zhu) 要 包 括 全(quan) 基 因 組 重 測(ce)(ce) 序(xu)（whole-genomesequencing，WGS）、全(quan)外顯子組測(ce)(ce)序(xu)（whole-exomesequencing，WES）和(he)(he)目標區(qu)域測(ce)(ce)序(xu)（Targeted regionssequencing，TRS），它們同屬于(yu)新一代測(ce)(ce)序(xu)技(ji)術(shu)(shu)。總體(ti)而言，NGS 技(ji)術(shu)(shu)具有通量大、時間短、精確(que)度高和(he)(he)信息量豐富(fu)等(deng)優點，使得遺傳學者可以在短時間內對感興趣的(de)基因進行精確(que)定位。但這些不同的(de)測(ce)(ce)序(xu)技(ji)術(shu)(shu)在測(ce)(ce)序(xu)范(fan)圍(wei)、數據分析量以及(ji)測(ce)(ce)序(xu)費用(yong)和(he)(he)時間等(deng)方(fang)面又(you)有很(hen)大差別，如(ru)果選(xuan)擇(ze)適(shi)合的(de)方(fang)法，對于(yu)臨床診(zhen)斷和(he)(he)科(ke)學研(yan)究將起到(dao)事半(ban)功倍(bei)的(de)作(zuo)用(yong)。
2.1 目標區域測序
目前常(chang)用的(de)是(shi)(shi)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)(xin)片(pian)技(ji)術(shu)。其(qi)測(ce)序(xu)原理是(shi)(shi)基(ji)(ji)(ji)于(yu) DNA 雜(za)交原理，利用目標(biao)(biao)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)區域(yu)定(ding)(ding)制(zhi)的(de)探針與(yu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu) DNA 進(jin)(jin)行芯(xin)(xin)片(pian)雜(za)交或(huo)溶液(ye)雜(za)交，將(jiang)(jiang)目標(biao)(biao)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)區域(yu) DNA 富集，再通(tong)過(guo)(guo)NGS 技(ji)術(shu)進(jin)(jin)行測(ce)序(xu)。其(qi)測(ce)序(xu)過(guo)(guo)程是(shi)(shi)通(tong)過(guo)(guo)把數以(yi)(yi)萬計的(de) cDNA 或(huo)寡聚核苷酸(suan)置于(yu)芯(xin)(xin)片(pian)上制(zhi)成列(lie)陣(zhen)(zhen)，將(jiang)(jiang)芯(xin)(xin)片(pian)上固定(ding)(ding)好(hao)的(de)已知序(xu)列(lie)的(de)核苷酸(suan)探針與(yu)溶液(ye)中(zhong)含有熒光標(biao)(biao)記的(de)相應核酸(suan)序(xu)列(lie)進(jin)(jin)行互(hu)補配對，根據測(ce)序(xu)儀所(suo)顯示強熒光的(de)位(wei)置和(he)強度，獲取每組(zu)點(dian)(dian)陣(zhen)(zhen)列(lie)信息，再利用生(sheng)物信息學算法(fa)確定(ding)(ding)目的(de)靶核苷酸(suan)的(de)序(xu)列(lie)組(zu)成。測(ce)序(xu)所(suo)選(xuan)定(ding)(ding)的(de)目標(biao)(biao)區域(yu)可以(yi)(yi)是(shi)(shi)連續的(de) DNA 序(xu)列(lie)，也可以(yi)(yi)是(shi)(shi)分布在同(tong)(tong)一(yi)個(ge)染色(se)體不同(tong)(tong)區域(yu)或(huo)不同(tong)(tong)染色(se)體上的(de)片(pian)段(duan)。目標(biao)(biao)區域(yu)測(ce)序(xu)技(ji)術(shu)，對于(yu)以(yi)(yi)往(wang)通(tong)過(guo)(guo)連鎖(suo)分析將(jiang)(jiang)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)突(tu)變(bian)(bian)鎖(suo)定(ding)(ding)在染色(se)體某一(yi)片(pian)段(duan)區域(yu)內，但(dan)無法(fa)找(zhao)出突(tu)變(bian)(bian)是(shi)(shi)一(yi)個(ge)非常(chang)好(hao)的(de)進(jin)(jin)一(yi)步檢測(ce)手段(duan)。2010 年，Nicholas等使用基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)分型芯(xin)(xin)片(pian)聯合連鎖(suo)分析技(ji)術(shu)，成功發現頭小畸形的(de)新基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin) WDR62，文章(zhang)發表在《NatGenet》雜(za)志。類似的(de)研(yan)究在家族(zu)性(xing)胰腺(xian)癌(ai)中(zhong)確定(ding)(ding) 8 個(ge)候選(xuan)變(bian)(bian)異(yi)位(wei)點(dian)(dian)和(he)在家族(zu)性(xing)滲出性(xing)玻(bo)璃體視(shi)網膜(mo)病變(bian)(bian)發現易(yi)感基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin) TSPAN12。
基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)芯(xin)片測(ce)序(xu)技(ji)術(shu)可以將經(jing)過連鎖分(fen)析鎖定了目標(biao)范(fan)圍或(huo)經(jing)過全(quan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)篩(shai)選的(de)(de)特定基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)或(huo)區(qu)域進行更深一層的(de)(de)研究，是(shi)解決(jue)連鎖分(fen)析無法發現致病基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)有(you)(you)效(xiao)手段。基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)芯(xin)片技(ji)術(shu)對于(yu)已知基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)突變(bian)的(de)(de)篩(shai)查具有(you)(you)明顯優勢，可以快(kuai)速、全(quan)面(mian)地檢測(ce)出目標(biao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)突變(bian)。同時，由(you)于(yu)目標(biao)區(qu)域受到了限制，測(ce)序(xu)范(fan)圍大(da)幅(fu)度減(jian)少，測(ce)序(xu)時間和費用(yong)相應降低(di)。但基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)芯(xin)片檢測(ce)所需要(yao)的(de)(de) DNA 的(de)(de)量要(yao)大(da)，由(you)于(yu)已提取的(de)(de) DNA 存(cun)在降解的(de)(de)風險(xian)，用(yong)于(yu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)芯(xin)片研究的(de)(de)血(xue)標(biao)本(ben)最好是(shi)冰凍的(de)(de)全(quan)血(xue)，這樣(yang)可以使(shi)用(yong)于(yu)檢測(ce) DNA 的(de)(de)量有(you)(you)充分(fen)保(bao)證。
2.2 全外顯子組測序 （WES）
外(wai)顯(xian)子組(zu)(zu)是(shi)單(dan)個(ge)個(ge)體的(de)基(ji)因(yin)組(zu)(zu) DNA 上所有(you)蛋白質(zhi)編碼序(xu)(xu)列的(de)總合。人(ren)類(lei)外(wai)顯(xian)子組(zu)(zu)序(xu)(xu)列約(yue)占人(ren)類(lei)全(quan)部基(ji)因(yin)組(zu)(zu)序(xu)(xu)列的(de) 1%，但(dan)大約(yue)包含 85% 的(de)致病突變。WES 是(shi)利用序(xu)(xu)列捕(bu)獲(huo)技(ji)術將全(quan)外(wai)顯(xian)子區(qu)域 DNA 捕(bu)捉并(bing)富集后進行高通量測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)基(ji)因(yin)分析方法。采用的(de)技(ji)術平(ping)臺主要(yao)是(shi)羅(luo)氏公(gong)(gong)司(si)的(de) SeqCap EZ 全(quan)外(wai)顯(xian)子捕(bu)獲(huo)系(xi)統，Illumina 公(gong)(gong)司(si)的(de) Solexa 技(ji)術和(he)(he) Agilent 公(gong)(gong)司(si)的(de) SureSelect 外(wai)顯(xian)子靶向序(xu)(xu)列富集系(xi)統。其(qi)捕(bu)獲(huo)的(de)目標區(qu)在 34 ~ 62 M 之間，不(bu)僅包括編碼區(qu)同(tong)(tong)(tong)時也加入了部分非(fei)編碼區(qu)。NGS 的(de)測(ce)(ce)序(xu)(xu)過(guo)程主要(yao)包括DNA 測(ce)(ce)序(xu)(xu)文庫的(de)制備(bei)、錨定橋接、PCR 擴增、單(dan)堿基(ji)延伸測(ce)(ce)序(xu)(xu)和(he)(he)數(shu)據分析。研究者根據測(ce)(ce)序(xu)(xu)儀捕(bu)獲(huo)到在測(ce)(ce)序(xu)(xu)過(guo)程中(zhong)摻(chan)入有(you)不(bu)同(tong)(tong)(tong)熒(ying)光(guang)標記(ji)堿基(ji)片段(duan)，經計算機將熒(ying)光(guang)信號轉化(hua)成不(bu)同(tong)(tong)(tong)顏(yan)色的(de)測(ce)(ce)序(xu)(xu)峰圖和(he)(he)堿基(ji)序(xu)(xu)列。基(ji)因(yin)測(ce)(ce)序(xu)(xu)結果(guo)與NCBI的(de)SNP數(shu)據庫、千人(ren)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)數(shu)據庫等國(guo)際(ji)權威數(shu)據庫比(bi)對，最終確(que)定是(shi)否為突變基(ji)因(yin)。
自NGS 技術(shu)問世以來(lai)，利用 WES 在臨床疾(ji)(ji)病(bing)致病(bing)基(ji)因(yin)(yin)的(de)鑒定研(yan)究中(zhong)取得前所未有的(de)成(cheng)果。這些(xie)(xie)成(cheng)果不僅集中(zhong)在單基(ji)因(yin)(yin)遺(yi)傳疾(ji)(ji)病(bing)，還(huan)在多基(ji)因(yin)(yin)影響的(de)復(fu)雜疾(ji)(ji)病(bing)中(zhong)獲得大(da)量相(xiang)關基(ji)因(yin)(yin)的(de)發(fa)現(xian)。在單基(ji)因(yin)(yin)遺(yi)傳性(xing)疾(ji)(ji)病(bing)中(zhong)，如視網膜色素變性(xing)、終端骨發(fa)育不良等發(fa)現(xian)新(xin)(xin)基(ji)因(yin)(yin)或已知(zhi)基(ji)因(yin)(yin)新(xin)(xin)突變。在一些(xie)(xie)罕見的(de)疾(ji)(ji)病(bing)中(zhong)，如 Kabuki 綜合征、家族性(xing)混合型(xing)低脂血(xue)癥和脊髓小(xiao)腦共濟失(shi)調癥等疾(ji)(ji)病(bing)中(zhong)發(fa)現(xian)新(xin)(xin)的(de)致病(bing)基(ji)因(yin)(yin)。同時(shi)，在小(xiao)細(xi)胞肺癌(ai)、慢(man)性(xing)淋巴細(xi)胞性(xing)白血(xue)病(bing)等腫瘤研(yan)究和諸如肥胖癥、腦皮質發(fa)育不良等復(fu)雜疾(ji)(ji)病(bing)的(de)研(yan)究中(zhong)也取得豐碩成(cheng)果。
WES 技(ji)(ji)術在篩查(cha)范圍和(he)檢(jian)出(chu)率等(deng)方(fang)面較(jiao)其他(ta)測(ce)序技(ji)(ji)術具(ju)有(you)明顯的(de)(de)(de)優勢。例如(ru)，對(dui)(dui)于(yu)(yu)采(cai)用(yong) Sanger測(ce)序和(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)芯片測(ce)序不(bu)能篩查(cha)出(chu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)樣本(ben)，可以(yi)(yi)(yi)采(cai)用(yong) WES 來進(jin)(jin)一(yi)步基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)篩查(cha)鑒定(ding)。應用(yong) WES技(ji)(ji)術能夠獲得較(jiao)傳統 Sanger 等(deng)方(fang)法對(dui)(dui)編碼(ma)區測(ce)序更(geng)深(shen)的(de)(de)(de)覆蓋度和(he)更(geng)準確(que)的(de)(de)(de)數(shu)據。由(you)于(yu)(yu)信息(xi)(xi)量的(de)(de)(de)大(da)幅度增加(jia)，WES 可以(yi)(yi)(yi)獲得更(geng)多個(ge)體(ti)的(de)(de)(de)編碼(ma)區信息(xi)(xi)，因(yin)(yin)(yin)(yin)此(ci)成為(wei)檢(jian)測(ce)致病(bing)(bing)(bing)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)和(he)易感基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)位點(dian)的(de)(de)(de)有(you)效手段。與連(lian)鎖分析定(ding)位方(fang)法比較(jiao)，WES 對(dui)(dui)家(jia)系(xi)(xi)(xi)的(de)(de)(de)要求并(bing)不(bu)十分嚴格(ge)(ge)，在單(dan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)遺傳病(bing)(bing)(bing)同一(yi)家(jia)系(xi)(xi)(xi)中有(you) 2 ~3 個(ge)患者和(he) 1 個(ge)正(zheng)常人(ren)即可進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)致病(bing)(bing)(bing)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)鑒定(ding)研究(jiu)，而不(bu)需要連(lian)續三代的(de)(de)(de)遺傳家(jia)系(xi)(xi)(xi)。由(you)于(yu)(yu)不(bu)需要嚴格(ge)(ge)的(de)(de)(de)三代以(yi)(yi)(yi)上的(de)(de)(de)遺傳家(jia)系(xi)(xi)(xi)，WES 使以(yi)(yi)(yi)前不(bu)能進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)研究(jiu)的(de)(de)(de)家(jia)系(xi)(xi)(xi)成為(wei)可能。不(bu)僅對(dui)(dui)于(yu)(yu)單(dan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)遺傳病(bing)(bing)(bing)是一(yi)個(ge)很好的(de)(de)(de)研究(jiu)手段，對(dui)(dui)于(yu)(yu)許多常見病(bing)(bing)(bing)，如(ru)腫(zhong)瘤、糖(tang)尿(niao)病(bing)(bing)(bing)等(deng)疾病(bing)(bing)(bing)也可進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)大(da)規模比較(jiao)研究(jiu)。
2.3 全基因組重測序 （WGS）
WGS 是對已知基因組序列的物種進行不同個體的全基因組的測序，經過數據分析后對序列進行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對不同組織進行測序并分析體細胞突變的一種研究方法。盡管 WES 可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，從而找到個體間的差異，但對于外顯子以外的區域則不能有效地進行基因檢測。對于此種情況，目前還要借助WGS 進行全基因組檢測。但由于人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度。因此，需要重復測序或雙端測序，由此帶來測序成本的大幅度提高和由于不能達到足夠的測序深度所導致的結果準確性的降低。而對于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測費用也是難以承受的。盡管如此，對于部分臨床研究和 WES 不能解決的科研課題還需要借助 WGS進行更加全面的基因檢測。
